反相高效液相色譜法同時測定仙靈骨葆滴丸中淫羊藿苷和補骨脂素及異補骨脂素的含量

錢南萍， 萬維香， 魏潤新

(江蘇泰州市人民醫院，江蘇泰州 225300)

仙靈骨葆能顯著提高腰椎骨密度，對中老年和絕經期患者以及骨折、骨壞死、骨關節炎等骨病有良好的療效和安全性［1］。仙靈骨葆滴丸是由淫羊藿、補骨脂、川續斷等多味中藥組成，具有滋補肝腎，接骨續筋的功效，用于骨質疏松癥，骨折，骨關節炎，骨無菌性壞死等。處方中主藥淫羊藿作為傳統的補腎壯陽中藥，因其獨特的化學成分和顯著的生物活性一直是國內外研究的熱點之一［2］，而補骨脂素及異補骨脂素亦是補骨脂中的主要活性成分。目前文獻對仙靈骨葆質量的控制主要是分別檢測淫羊藿苷的含量或補骨脂素及異補骨脂素［3-5］，為有效地控制產品質量，本實驗采用高效液相色譜法同時測定仙靈骨葆滴丸中淫羊藿苷和補骨脂素及異補骨脂素的含量，方法簡便可行，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters HPLC系統(1525泵、2487紫外可見光光度檢測器、Empower色譜工作站)。

1.2 試藥 仙靈骨葆滴丸(江蘇清江藥業有限公司，批號:20070104、20070106、20070108);淫羊藿苷對照品(批號0737-200111);補骨脂素對照品(批號0730-200309)、異補骨脂素對照品(批號0738－200108)均為中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純(Merck KgaA，Germany);冰醋酸(分析純，南京化學試劑廠);超純水:自制。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流動相:甲醇-1.5%冰醋酸水溶液(55∶45);檢測波長:246 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含淫羊藿苷 836.8 μg、補骨脂素 97.28 μg、異補骨脂素75.52 μg的混合溶液，搖勻，以此作為對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液1 mL，加甲醇稀釋至4 mL，搖勻，制成對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取仙靈骨葆滴丸1.010 9 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水(50∶50)的溶液10 mL，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用上述溶液補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密稱取缺淫羊藿和補骨脂的陰性滴丸0.999 6 g，按樣品溶液的制備方法制成陰性溶液即得。

2.3 系統適用性試驗 取對照品混合溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進樣10 μL測定，結果表明，在此色譜條件下，淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素分離良好，陰性樣品對測定無干擾，結果見圖1。

2.4 線性關系實驗 精密吸取對照品溶液0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，分別置于 2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，依次進樣10 μL，測定峰面積，將所得峰面積與進樣量進行線性回歸，得淫羊藿回歸方程為Y=1 610 060.305X+50 445.034(r=0.999 7);補骨脂素回歸方程為Y=9 997.497X+32 817.220(r=0.999 7);異補骨脂素回歸方程為Y=11 049.64X+15 105.56(r=0.999 6)。結果表明，淫羊藿苷進樣量在0.523～4.184 μg范圍內、補骨脂素進樣量在60.8～486.4 ng范圍內、異補骨脂素進樣量在47.2～377.6 ng范圍內與峰面積線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取淫羊藿苷(209.2 μg/mL)、補骨脂素(24.32 μg/mL)、異補骨脂素(18.88 μg/mL)對照品混合溶液，重復進樣6次，每次10 μL，結果，淫羊藿苷峰面積平均值為3 435 974，RSD為1.09%;補骨脂素峰面積平均值為2 466 573，RSD為0.34%;異補骨脂素峰面積平均值為2 094 161，RSD為0.53%。試驗表明，該法精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按2.2.2項下方法制備樣品溶液，進行測定，結果淫羊藿苷含量RSD為1.4%;補骨脂素含量RSD為2.04%;異補骨脂素含量RSD為1.82%，表明方法重現性良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一樣品溶液10 μL，在0、2、4、6、8、12 h 分別進樣，記錄峰面積。結果，淫羊藿苷峰面積RSD為1.12%;補骨脂素峰面積RSD為1.64%;異補骨脂素峰面積RSD為1.10%，表明樣品溶液中淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素在12 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取6份已知含量的仙靈骨葆細粉適量(約0.4 g)，置錐形瓶中，分別精密加入一定量的淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液，揮干溶劑后，加甲醇-水(50:50)10 mL，精密稱定，密塞，超聲提取1 h，放冷，精密稱定，再用甲醇-水(50:50)補足減失重量，用微孔濾膜濾過，精密吸取續濾液按2.1項下色譜條件，分別進樣10 μL測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)Tab.1 Results of recovery test(n=6)

2.9 樣品測定 取3批樣品，按2.2.2項下方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算樣品中淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，結果見表2。

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗參考有關文獻［6-7］，分別選擇不同比例的甲醇-1.5%冰醋酸溶液為流動相，均可使處方中3種成分較好的分離，但實驗結果表明，采用甲醇-1.5%冰醋酸溶液(55:45)為流動相，3種成分的分離效果和峰形較理想。

表2 樣品含量測定結果(n=3)Tab.2 Content determination of samples(n=3)

3.2 提取條件的選擇 試驗過程中對供試品溶液的處理方法進行了考察，通過分別采用甲醇、甲醇-水的不同比例超聲提取，并對不同提取時間進行比較試驗，實驗中將樣品分別超聲0.5、1、1.5 h后測定淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素的含量，結果表明，用甲醇-水(50:50)，超聲1 h處理樣品為最佳，可使樣品中的淫羊藿苷、補骨脂素與異補骨脂素提取完全，并能很好地避免滴丸中其他成分的干擾。

3.3 測定波長的選擇 經紫外掃描得知淫羊藿苷的最大吸收波長是270 nm，而補骨脂素和異補骨脂素的最大吸收波長是246 nm，文獻報道［8-11］為分別采用246，270 nm進行測定的，根據實驗結果，表明采用246 nm同時測定3種成分時的響應值和峰形均優于采用270 nm測定結果。本實驗建立的HPLC法，通過對色譜條件的優化，可以同時測定仙靈骨葆滴丸中3種有效成分含量，方法操作簡便，靈敏度高，結果準確，可作為該品種實際生產中質量控制的標準。

［1］唐卡毅.仙靈骨葆防治骨質疏松癥的研究進展［J］.重慶醫學，2009，38(12):1535-1537.

［2］張維波.仙靈骨葆膠囊治療骨質疏松性壓縮性骨折32例療效觀察［J］.中國醫療前沿，2009，14(13):56.

［3］周春燕，王正俊，嚴曉星.仙靈骨葆顆粒的質量標準研究［J］.安徽醫學，2008，12(1):16-18.

［4］劉永剛，趙保勝，王秀麗，等.HPLC法測定仙靈骨葆分散片中淫羊藿苷的含量［J］.中國實驗方劑學，2009，15(9):6-7.

［5］李振國，李忠保，王海波.HPLC法測定仙靈骨葆顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量［J］.中醫研究，2009，25(1):25-26.

［6］蘇紅艷.HPLC法測定婦寧康膠囊中淫羊藿苷含量［J］.遼寧中醫藥大學學報，2008，10(4):134-135.

［7］張壯麗，劉 力，徐德生.高效液相色譜法測定補腎益氣顆粒中補骨脂素和異補骨脂素含量［J］.時珍國醫國藥，2007，18(2):373-374.

［8］阮桂平.HPLC測定仙珍骨寶膠囊中淫羊藿苷的含量［J］.中成藥，2008，30(4):附 10-11.

［9］鐘鏡金，黃曉其，龍彥綱，等.高效液相色譜法測定骨康口服液中補骨脂素和異補骨脂素的含量［J］.時珍國醫國藥，2008，19(2):453-454.

［10］伍 慶，周 寧，馮澤熹，等.HPLC測定仙靈骨葆膠囊中淫羊藿苷和淫羊藿定C含量［J］.中成藥，2009，31(8):1211-1213.

［11］劉麗華，高淑麗，孫宇紅，等.HPLC法測定仙靈骨葆顆粒中淫羊藿苷的含量［J］.河北醫藥，2008，31(15):2002-2003.