SPE-HPLC法測定胃腸寧片中3種生物堿的含量

丘明明， 黃玉華

(廣西食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021)

胃腸寧片是在胃腸寧沖劑的基礎上改進為片劑，由布渣葉、辣蓼 、番石榴葉、火炭母、功勞木等五味中藥經提取加工精制而成，有清熱祛濕，健胃止瀉功效;用于急性腸胃炎，小兒消化不良。其質量標準收載于衛生部藥品標準《中藥成方制劑》［1］，無含量測定。處方中功勞木所含有的小檗堿原型生物堿為鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿［2］，目前此類成分都是用甲醇或鹽酸－甲醇提取，用中性氧化鋁柱進行純化，再用 HPLC 法進行含量測定［3－11］。經過實驗發現該制劑經提取純化后色譜圖雜質峰仍較多，干擾成分峰的測定。本實驗采用固相萃取技術，有效地除去雜質干擾，用HPLC同時測定胃腸寧片中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿3種生物堿的含量，試驗結果表明該方法操作簡便，準確性、重復性好，可作為該制劑質量控制的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(含DAD檢測器)，MILLI—Q純水發生器;梅特勒電子天平;Waters公司WCX型弱陽離子交換SPE小柱(60 mg/3 mL);鹽酸小檗堿對照品(批號:110713－200910，供含量測定用，以97.9%計)、鹽酸巴馬汀對照品(批號:110732－200506，供含量測定用)和鹽酸藥根堿對照品(批號:0733－200005，供鑒別用，經HPLC法分析，以面積歸一化法計算純度為:98.1%)均為中國藥品生物制品檢定所提供;胃腸寧片(由廣西靈峰藥業有限公司提供，批號:080701、081001、091001);陰性對照樣品(按照胃腸寧片制備工藝的方法制備缺功勞木的陰性樣品，由廣西靈峰藥業有限公司提供)。乙腈為色譜純試劑，水為高純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

圖1 陰性樣品、對照品、樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of negative samples，reference substances and sample

2.1 色譜條件 色譜柱:Hvydro－RP 80A C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈－0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(磷酸調pH2.8)(27:73);流速:1.0 mL/min;檢測波長為265 nm;柱溫:35℃;進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 取鹽酸藥根堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL各含0.5 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%磷酸甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用25%磷酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，揮去甲醇，加于WCX型弱陽離子交換小柱(預先依次用甲醇1 mL、水1 mL活化)上，流速約每分鐘1 mL，依次用水6 mL、25 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5)1 mL洗滌，棄去洗液，抽干1 min，繼用甲醇3 mL洗滌，棄去洗液，再用5%甲酸甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣精密加入甲醇2 mL使溶解，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 取陰性對照樣品適量，按2.3項下的方法進行操作，制得陰性樣品溶液。

2.5 干擾試驗 分別吸取對照品溶液和供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件記錄色譜圖，鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿各峰的保留時間分別為9、15、17 min左右，均與鄰近峰達到基線分離，分離度良好(R＞1.5)，陰性對照樣品溶液對測定無干擾，結果見圖1。

2.6 線性范圍的考察 精密稱取鹽酸藥根堿對照品10.97 mg(純度:98.1%)，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密稱取鹽酸巴馬汀對照品11.53 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.05 mg(純度:97.9%)，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密量取上述 3 種貯備液 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

按2.1項色譜條件分別進樣10 μL，以對照品的進樣量(ng)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，鹽酸藥根堿回歸方程為:Y=3.890 7X+0.504 2，r=1.000 0;鹽酸巴馬汀回歸方程為:Y=3.749 6X－0.748 0，r=1.000 0;鹽酸小檗堿回歸方程為:Y=3.905 6X－0.870 0，r=0.999 7。結果表明鹽酸藥根堿在3.443 7～6.887 4 ng;鹽酸巴馬汀在2.306～23.060 ng及鹽酸小檗堿在2.361 3～23.613 5 ng范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.7 精密度試驗 取同一份供試品溶液(091001批)，按2.1項色譜條件重復進樣6次，記錄色譜峰面積，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿RSD分別為0.64%、0.69%、0.76%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(091001批)，分別于 0、2、4、8、12、18、24 h，按 2.1 項色譜條件，進樣測定7次，記錄色譜峰面積，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿RSD分別為0.47%、0.90%、0.76%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗 取同一批樣品(091001批)6份，按2.3項下方法制成供試品溶液，并按2.1項下色譜條件測定，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量分別為0.070 73 mg/g、0.055 60 mg/g、0.048 06 mg/g，RSD 分別為 1.17%、0.91%、0.33%。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(091001批)，共9份，每份約0.25 g，平均分成3組，分別精密加入一定量的鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品，按2.3項方法操作，并按2.1項下色譜條件測定，計算回收率，結果見表1。

表1加樣回收率實驗結果Tab.1 Test results of recovery test

2.11 樣品測定 取不同批號的樣品，按2.3項下 方法制成供試品溶液，并按2.1項下色譜條件測定含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=3)Tab.2 Determination results of samples(n=3)

3 討論

3.1 波長的選擇 用二極管陣列檢測器分別對樣品溶液和對照品溶液進行檢測，結果鹽酸藥根堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品、鹽酸小檗堿對照品分別在265 nm、266 nm和265 nm處有最大吸收，樣品峰與對照品一致，故測定波長定為265 nm。

3.2 色譜柱的選擇 比較Hvydro－RP 80A C18、Kromasil C18和CAPCELLPAK MGII C183種不同品牌的色譜柱，結果所測成分峰形良好，且與其它成分峰達到基線分離。

3.3 提取條件的選擇 (1)比較鹽酸－甲醇和磷酸－甲醇溶液提取樣品，結果發現兩種提取液經過固相萃取小柱后，前者被測成分不被吸附劑吸附，隨著雜質流出，而后者被測成分被吸附劑牢牢吸附，與雜質有效分離。(2)比較15%、20%、25%、30%的磷酸甲醇溶液提取樣品，結果發現用25%磷酸甲醇溶液提取的含量最高。(3)比較超聲處理時間15、30、60 min，結果發現超聲處理30 min即能將被測成分提取完全。(4)比較用25%磷酸甲醇溶液15、20、25、50 mL提取樣品，結果發現用25 mL即能將被測成分提取完全。

3.4 固相萃取柱的選擇 鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿都是季銨堿，實驗中比較了MCX強陽離子交換和WCX弱陽離子交換SPE小柱，這兩種SPE小柱對堿性化合物都有強性的保留，能使堿性化合物從酸性和中性雜質中分離出來，但強堿如季銨堿類會不可逆的保留在強陽離子交換柱上，而弱陽離子交換作用則可以洗脫它們，與強陽離子交換柱比較，弱陽離子交換柱上的吸附劑的pKa適用范圍更廣，從而使洗脫條件的靈活性更大。故選擇WCX弱陽離子交換SPE小柱。

3.5 SPE洗脫條件的優化 首先考察上樣體積(0.5、1.0、2.0、3.0 mL)，由于樣品中含雜質較多，發現上樣體積3.0 mL時，溶液無法流出柱子，試驗無法進行，說明3.0 mL已經超載。為了確保SPE能處于有效吸附狀態，確定過柱體積為1 mL。其次考察洗脫雜質的溶劑水和甲醇的體積(4、5、6、7、8 mL 和1、2、3、4、5 mL)，結果發現用水6 mL 和甲醇3 mL，就能有效地除去雜質。最后考察洗脫被測成分的溶劑5%甲酸甲醇溶液的體積(3、5、8、10 mL)，結果發現洗脫溶劑3 mL～10 mL結果相差都不大，為了洗脫完全又不浪費溶劑，故選擇洗脫溶劑體積為5 mL。

［1］衛生部藥品標準中藥成方制劑［S］.第二冊.1990:165.

［2］國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(第三冊)［M］.上海:上海科學技術出版社，1999.

［3］李文仕.RP－HPLC測定胃腸寧片中鹽酸小檗堿的含量［J］.現代食品與藥品雜志，2007，17(5):40－42.

［4］黃 捷，桑 彤，覃紅萍.反相高效液相色譜法測定胃腸寧片中鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量［J］.中國醫院藥學雜志，2002，22(12):723－724.

［5］胡春麗，王冬梅，張 鵬，等.RP－HPLC法同時測定當歸龍薈片中黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28(12):2011－2014.

［6］楊傳玨，楊仲文，周本宏，等.HPLC法測定交泰片中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國藥師，2009，12(8):1083－1085.

［7］高 靨，王冬梅，欒 爽，等.HPLC法同時測定芩連片中鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2008，25(6):480－483.

［8］曾三平，雷 鵬.HPLC法測定香連制劑中鹽酸小檗堿、巴馬汀和藥根堿含量［J］.中國藥事，2007，21(8):598－600.

［9］孟 蕾，沈圣民，張海鳴，等.高效液相色譜法測定姜連止瀉片中鹽酸小檗堿的含量［J］.時珍國醫國藥，2010，21(2):203－204.

［10］郭麗芳，余衛兵，廉 辰，等.HPLC法測定囊蟲消膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國藥師，2010，13(1):148－149.

［11］肖 平，李三新.反相高效液相色譜法測定味黃連丸中鹽酸小檗堿的含量［J］.中南藥學，2009，7(11):879－880.