鹽制對杜仲化學成分含量變化的影響

劉可鑫， 周 翎， 劉攀峰， 張萌萌， 曹 洋， 許 枬*

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600;2.大連海港醫院，遼寧 大連 116012;3.撫順市農業特產學校，遼寧撫順 113123)

杜仲為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，是我國名貴滋補藥材［1］，臨床以炮制應用為主［2］。杜仲的歷代炮制方法有鹽制、姜制、蜜制等，現以鹽制為主［3］，根據“入鹽走腎”的炮制理論，認為其鹽制的炮制作用是增強補肝腎，強筋骨的功效［3］。由于杜仲炮制歷來以“斷絲”為度［4］，有人提出切制也可斷絲，沒有必要鹽制的看法，也有人一味追求“斷絲”，甚至將杜仲炮制成杜仲炭(斷絲完全)。顯然“斷絲”的本質已經成為杜仲鹽制必須解決的重要問題。因此，有必要深入研究杜仲鹽制“斷絲”所引起的化學變化，為其炮制原理研究奠定基礎。

我們的前期研究發現，杜仲在不同的溫度條件下鹽制，化學成分變化顯著［5］:鹽制后(溫度超過140℃)，杜仲中環烯醚萜類成分含量顯著減少的同時，炮制品薄層色譜中，在與生品相同的位置上，Rf值約0.6的粉色斑點和Rf值約0.8的黃綠色斑點含量明顯增加。據此可以說明，鹽制后杜仲中有些化學成分的含量增加。分析上述情況，我們認為炮制溫度所產生的鹽制杜仲化學成分的差異可能會造成其療效的迥異。為深入探討鹽制“斷絲”的物質基礎，本實驗在前期研究的基礎上，系統地分離了鹽制后杜仲的增加成分，并結合色譜分析揭示鹽制前后杜仲化學成分的變化，為杜仲的鹽制工藝研究和炮制品質量標準研究提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 上海滬南科學儀器聯營廠2022A型數顯電熱恒溫干燥箱;核磁共振譜用Burker Avance 600型核磁共振光譜儀;Angilent 1100 series高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);柱層析與薄層層析用硅膠均為青島海洋化工廠產品。

1.2 藥材 杜仲藥材購自北京同仁堂，產地貴州。經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室王冰教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮。

2 杜仲炮制后增量成分的分離

2.1 提取與分離 為更好地控制炮制溫度，本實驗取生杜仲絲，以2%鹽水潤透，平鋪在不銹鋼方盤內，放入烘箱，60℃烘干。再將上述處理好的杜仲絲在160℃加熱至斷絲，制成鹽制杜仲。

取上述制成的鹽杜仲10 kg，粉碎，用95%乙醇滲漉提取1周，提取液回收乙醇，濃縮，得浸膏1 100 g。取所得浸膏800 g，加水制成混懸液，分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。采用薄層色譜檢查，結果表明，炮制后的增加成分主要集中在氯仿萃取物中，因此對氯仿萃取物進行分離。取氯仿層浸膏416.8 g，用甲醇溶解，按樣品與硅膠1:1.5的比例，取600 g硅膠拌樣，揮干溶劑待用。以樣品與硅膠1:2.5的比例，濕法裝硅膠柱，硅膠用量為1 000 g。將樣品干法上于硅膠柱頂端，以石油醚-丙酮(100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1)為洗脫劑，進行梯度洗脫。每300 mL為一個流分，收集洗脫成分。采用薄層色譜法，將各流份與生杜仲絲、鹽制杜仲進行對照分析，跟蹤檢查炮制后含量增加的成分，發現石油醚-丙酮(10:1)部分的Fr.7含有炮制后含量增加的黃綠色斑點，采用相同的分析方法確定石油醚-丙酮(10:1)部分的Fr.8含有炮制后含量增加的粉紅色斑點。將Fr.7經反復硅膠柱層析，再經Sephadex LH-20柱層析純化，得到化合物1。將Fr.8采用硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(2:1→1:1)進行梯度洗脫，其中石油醚-乙酸乙酯(2:1)洗脫的流份，經HPLC制備，得到化合物2和化合物3;石油醚-乙酸乙酯(1:1)洗脫的流份，經HPLC制備，得到化合物4和化合物5。

2.2 結構鑒定

化合物1:淡黃色油狀物，三氯化鐵試劑顯鐵紅色，5%香草醛濃硫酸試劑顯灰綠色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:9.51(1H，d，J=7.8 Hz，CHO)，7.50(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，7.10(1H，dd，J=1.8，8.14 Hz，H-6)，7.18(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.81(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.60(1H，dd，J=7.8，15.6 Hz，H-8)，3.85(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:126.1(C-1)，110.6(C-2)，150.2(C-3)，148.0(C-4)，125.2(C-5)，123.8(C-6)，154.8(C-7)，115.2(C-8)，194.8(CHO)，55.0(OMe)。上述光譜數據與文獻［6］報道的阿魏醛基本一致，故鑒定化合物1為阿魏醛。

化合物2:白色針狀結晶，5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:6.93(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.78(1H，d，J=1.8，8.4 Hz，H-6″)，6.75(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，3.10(2H，m，H-1，5)，4.67(2H，J=4.2 Hz，d，H-2，6)，4.20(4H，m，H-4，8)，3.83(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:53.9(C-1，5)，71.1(C-4，8)，86.0(C-2，6)，132.3(C-1′，1″)，109.5(C-2′，2″)，147.6(C-3′，3″)，145.8(C-4′，4″)，114.6(C-5′，5″)，118.6(C-6′，6″)，54.9(OMe)。上述光譜數據與文獻［7］報道的松脂素數據基本一致，故鑒定化合物2為松脂素。

化合物3:白色針狀結晶，5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:6.75～6.94(6H，m，arom)，4.40(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)，4.84(1H，d，J=6 Hz，H-2)，3.84(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:54.3(C-1)，49.9(C-5)，69.2(C-4)，70.5(C-8)，88.0(C-2)，82.1(C-6)，132.4(C-1′)，129.9(C-1″)，109.4(C-2′)，109.0(C-2″)，147.4(C-3′)，147.7(C-3″)，145.2(C-4′)，146.0(C-4″)，114.6(C-5′，5″)，118.8(C-6′)，119.9(C-6″)，55.0(OMe)。上述光譜數據與文獻［8］報道的表松脂素數據基本一致，故鑒定化合物3為表松脂素。

化合物4:白色粉末，5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:3.12 ～3.29(2H，m，H-1，5)，3.84 ～4.25(4H，m，H-4，8)，4.69(2H，d，J=4.2 Hz，H-2，6)，6.64 ～ 6.94(5H，m，arom)，3.83(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:55.3(C-1)，55.5(C-5)，72.6(C-4)，72.7(C-8)，87.4(C-2)，87.6(C-6)，133.1(C-1′)，133.7(C-1″)，104.5(C-2′)，110.9(C-2″)，149.3(C-3′)，149.1(C-3″)，136.2(C-4′)，147.3(C-4″)，149.3(C-5′)，116.0(C-5″)，104.5(C-6′)，120.0(C-6″)，56.4(OMe)，56.7(OMe)。上述光譜數據與文獻［9］報道的中脂素數據基本一致，故鑒定化合物4為中脂素。

化合物5:白色粉末5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:3.29(2H，m，H-1，5)，4.12(4H，m，H-4，8)，4.83(1H，d，J=6 Hz，H-2)，4.41(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)，6.65 ～ 6.96(5H，m，arom)，3.84(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:55.6(C-1)，55.8(C-5)，70.6(C-4)，70.5(C-8)，83.5(C-2)，83.6(C-6)，131.3(C-1′)，133.8(C-1″)，104.0(C-2′)，110.5(C-2″)，149.2(C-3′)，148.8(C-3″)，134.7(C-4′)，146.6(C-4″)，149.2(C-5′)，116.0(C-5″)，104.0(C-6′)，119.4(C-6″)，56.4(OMe)，56.8(OMe)。上述光譜數據與文獻［9］報道(－)-medioresinol數據基本一致，故鑒定化合物5為(－)-medioresinol。

3 杜仲炮制后成分變化研究

3.1 TLC色譜鑒別 由于以前實驗已經采用薄層色譜法分析了炮制后含量降低的成分［5］，因此本實驗只分析炮制后含量增加的成分。將分離得到的5個化合物與杜仲160℃鹽制品的供試品點于同一薄層板上，以環己烷-氯仿-丙酮-甲醇(1:7:2:1.5)為展開劑，展開，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱，顯色，結果見圖1。

圖1 杜仲生品和炮制品的薄層圖譜Fig.1 TLC analysis of Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex with salt

由圖1可見，阿魏醛是炮制后含量明顯增加的化學成分。由于松脂素、表松脂素、中脂素、(－)-medioresinol的結構極其相似，且松脂素與表松脂素、中脂素與(－)-medioresinol分別互為立體異構體，所以該4個單體化合物在薄層圖譜中分離度很小，Rf值幾乎相同，不能很好的確認成分變化情況。但根據其Rf值，基本可以確認所分離的化學成分中有炮制后含量增加的成分。

3.2 HPLC分析 色譜條件:色譜柱Kromasil-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈為流動相 A，以0.1%磷酸水為流動相B，梯度洗脫(0 min 8:92;10 min 15: 95;25 min，15: 85;35 min，17:83;50 min，23:77;70 min，33:67)。流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm;進樣量:10 μL。柱溫:25 ℃。

供試品溶液的制備:取生杜仲絲及160℃制備鹽杜仲粉末各1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲40 min。冷卻后稱定重量，補足減失的重量。濾過，精密移取50 mL置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇使溶解，定容至5 mL量瓶中，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

對照品溶液的制備:取阿魏醛，松脂素，表松脂素，中脂素，(－)-medioresinol，京尼平苷酸，綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷，中脂素二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷各5 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并定容至刻度，搖勻，即得。

生品與炮制品的HPLC指紋圖譜分析:采用上述色譜條件，建立杜仲生品和鹽制品(160℃)HPLC指紋圖譜，以分離得到的阿魏醛，松脂素，表松脂素，中脂素，(－)-medioresinol以及前期研究分離得到的京尼平苷酸，綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷，中脂素二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷為對照品，對杜仲生品和炮制品的HPLC指紋圖譜的色譜峰進行標定。結果見圖2。

圖2 杜仲生品、炮制品HPLC指紋圖譜比較Fig.2 Comparative fingerprint of Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex with salt

由圖2可見，與(－)-medioresinol，中脂素，松脂素，表松脂素和阿魏醛分別對應的 19，20，21，22，23號峰均有所增高，與京尼平苷酸，綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷，中脂素二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷所對應的1，3，8，9，10號峰均有所減低，具體峰面積值變化見表1。

表1 杜仲鹽制前后成分色譜峰的保留時間和峰面積Table 1 Retention time and peak area of substances’peaks of Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex with salt

由表1可見，不同化學成分鹽制前后色譜峰面積變化較大，其中京尼平苷酸、綠原酸、松脂素二葡萄糖苷、中脂素二葡萄糖苷、丁香脂醇二葡萄糖苷的色譜峰面積鹽制后降低，而(－)-medioresinol、中脂素、松脂素、表松脂素、阿魏醛的色譜峰面積鹽制后則升高。

4 討論

經柱色譜分離，從鹽制杜仲中得到阿魏醛、(－)-medioresinol、中脂素、松脂素、表松脂素等5個杜仲炮制后含量增加的化學成分。根據薄層色譜以及HPLC色譜分析，證實所分離得到的5個化合物確為杜仲鹽制后含量增加的成分，其中4個成分為木脂素類的苷元，1個成分為簡單苯丙素類成分。由此說明鹽制溫度對杜仲中的木脂素類成分影響顯著。我們前期研究發現，杜仲鹽制后環烯醚萜類成分含量減少［5］;本研究又發現，炮制后杜仲中木脂素類成分的苷元含量增加，說明鹽制過程不僅對杜仲中環烯醚萜類化學成分的影響較大，對木脂素類成分的影響也十分顯著。因此杜仲鹽制工藝研究中要十分注重控制炮制溫度。

化學成分是功效的物質基礎，又是性味、歸經的物質基礎，因此要深入揭示杜仲的炮制原理和炮制作用，需要在化學成分研究的基礎上，對鹽制杜仲藥效作用的機理進行深入探討，結合化學成分和功效的差異及二者的相關性來闡釋杜仲的炮制原理，為杜仲的炮制工藝研究和炮制品質量控制標準的建立提供科學依據。

以往的研究報道［10］，杜仲中含有大量的木脂素二葡萄糖苷，如中脂素二葡萄糖苷，松脂醇二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷……，杜仲炮制后木脂素類成分的苷元顯著增加，可能是由于在炮制過程中，木脂素二葡萄糖苷的糖苷鍵斷裂，使木脂素二葡萄糖苷降解成相應的苷元所致。

TLC雖然具有操作簡單，分析速度快，不同顯色劑可以協助識別化學成分的優點，但由于其分離效率相對較低，有些結構相近或極性相似的化學成分在薄層色譜中分離效果不理想，因此炮制前后化學成分變化研究應采用多種色譜結合，綜合分析，揭示炮制前后化學成分變化情況。另外，本實驗采用杜仲生品和160℃鹽制品的對比分析考察炮制前后成分含量變化，雖然不能全面反應溫度對成分變化的影響，但結合薄層分析和HPLC分析，依然可以確認炮制溫度對杜仲化學成分的影響非常顯著。

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