多指標正交法優選樟幫枳殼飲片炮制工藝

張金蓮， 謝一輝， 何 敏， 龔千鋒， 姚冬琴， 李 果， 張的鳳

(江西中醫學院，江西南昌 330004)

枳殼系蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrus aurantiumL.和栽培變種的干燥未成熟果實。一般于7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥。枳殼生用有理氣寬中，行滯消脹的功效，用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，痰飲內停，食積不化，臟器下垂［1］。枳殼在臨床上除使用生品外，還常用炮制品，《中國藥典》收載的炮制品種為麩炒枳殼。江西樟幫法炮制枳殼飲片的特色是需將枳殼上架壓制，切制成“鳳眼片”，麩炒或蜜麩炒［2］。本實驗通過多指標正交法來優化樟幫枳殼的炮制工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ultimate 3000高效液相色譜儀，ultimate 3000 photodiode Array Detector，ultimate 3000 自動進樣器，ultimate 3000柱溫箱，ultimate 3000色譜工作站，AG245電子分析天平，Sartorius BS124電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，HH－2數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，高速萬能粉碎機(天津市泰斯特一儀器有限公司)，TN408LC型紅外測溫槍(上海儀迷杰光電技術有限公司)，KQ3200超聲波清洗器(昆山超聲儀器廠)，GZX－9146MBE型數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)。

1.2 對照品 柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號110722－200309)、新橙皮苷(由江西中醫學院重點實驗室楊武亮教授提供，含量99.34%);色譜純乙腈(美國Merck公司)，色譜純甲醇(美國Merck公司)。其他試劑均為分析純。

1.3 實驗藥材 枳殼原藥材購自江西天齊堂中藥飲片有限公司，經江西中醫學院藥學院中藥資源學科組褚小蘭教授鑒定為酸橙Citrus anrantiumL.干燥未成熟果實。

2 方法與結果

2.1 樟幫枳殼生品工藝研究

2.1.1 試驗設計 以樟幫傳統炮制方法的溫濕度和時間為基礎，結合預試驗的情況，采用L16(45)正交表對炮制溫度、炮制時間、炮制濕度三因素設計試驗，每因素設計四個水平，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.1.2 樟幫枳殼生品制備 枳殼原藥材用小刀挖去內瓤，洗凈泥沙，撈起，潤過夜(12 h)，壓扁，再上木架壓制，依照正交設計表L16(45)進行飲片炮制后，取出，切成0.2 cm厚的鳳眼片，干燥即得。

2.1.3 柚皮苷、新橙皮苷含量測定

2.1.3.1 色譜條件 色譜柱:ultimate 3000 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈－水(磷酸調pH值至3)(23∶77)，檢測波長:283 nm，流速:1.0 mL/min，柱溫:30℃。理論塔板數以柚皮苷計不低于3 000。對照品溶液、供試品溶液和溶劑的色譜圖見圖1。

2.1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品適量，加無水甲醇制成每1 mL含柚皮苷對照品0.079 12 mg、新橙皮苷對照品0.047 mg的混合對照品溶液。

2.1.3.3 供試品溶液的制備 取枳殼粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3.4 線性關系考察 取混合對照品溶液按2.1.3.1項下的色譜條件，自動進樣 4、8、12、16、20 μL，分別記錄色譜峰面積。以峰面積Y為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程分別為:柚皮苷:Y=32.24X－0.157 2，r=0.999 9，新橙皮苷:Y=38.872X+0.046 8，r=0.999 9。結果表明柚皮苷在 0.316 4 μg ～1.582 4 μg 范圍內，新橙皮苷 0.188 0 μg～0.940 0 μg范圍內線性關系良好。

2.1.3.5 精密度試驗 精密吸取對照品混合溶液10 μL，注入色譜儀，在相同的色譜條件下，重復進樣6次，以柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品的峰面積計算，兩者的RSD分別為2.28%，2.90%。結果表明精密度良好。

2.1.3.6 重復性試驗 取枳殼藥材粉末(40目)0.5 g，6份，精密稱定，分別按2.1.3.3項下方法制備供試品溶液，平行測定，供試品柚皮苷和新橙皮苷含量的RSD分別為0.61%，1.36%。結果表明該方法重現性良好。

2.1.3.7 穩定性試驗精密稱取枳殼藥材粉末(40目)0.5 g，按2.1.3.3項下制備供試品溶液，分別在0、1、2、4、5 d 進樣 10 μL，記錄色譜峰面積，計算柚皮苷和新橙皮苷色譜峰面積的RSD分別1.02%，2.00%，表明120 h內供試品穩定性良好。

2.1.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知柚皮苷和新橙皮苷含量的枳殼藥材6份，每份約0.25g，分別加入柚皮苷和新橙皮苷適量，按2.1.3.3項下的方法制備供試品溶液，測定，計算回收率，結果柚皮苷回收率為99.17%，RSD=2.26%(n=6)、新橙皮苷回收率為96.11%，RSD=3.17%(n=6)。

2.1.3.9 樣品測定 取按正交設計表炮制的枳殼飲片按2.1.3.3項下操作制備樣品溶液，進樣10 μL，測定，計算柚皮苷、新橙皮苷的含量。

2.1.4 性狀指標測定 枳殼壓制后需經發酵霉變并制成“鳳眼片”是樟幫枳殼的特色之一，霉變太過則影響外觀，不及則無法制成“鳳眼片”，故對樣品的霉變性狀和成型性進行評分，評分標準見表2、表3。

表2 霉變性狀評分表

表3 外觀成型評分表

2.1.5 結果分析 以不同工藝的因素為自變量，柚皮苷含量、新橙皮苷含量、成型性和霉變性狀的標準化值為評判指標，用13.0版SPSS統計軟件進行相關性和方差分析，結果見表4至表6。

表4 方差分析表(n=64)

表5 相關性分析表(n=64)

表6 變量分析表(n=64)

表4顯示在炮制工藝中，溫度、時間、濕度對工藝有顯著影響，影響程度依次是溫度＞時間＞濕度。以標準化值最高為優(表6)，最佳溫度為28℃，最佳濕度為92%，最佳時間確定:柚皮苷最佳為5 d，其次是3 d，新橙皮苷最佳為5 d，其次為3 d，成型最佳為5 d，霉變最佳為4 d，時間從分值來看應是5 d最佳，但考慮到5 d時間過長，大生產時影響生產效率，且時間與柚皮苷、新橙皮苷之間不存在明顯相關(表5)，此外，在實際操作中發現在溫度28℃、相對濕度92%、時間為3 d時成型性和霉變性狀均很好，5 d時飲片易發黑，發綠，影響外觀，故最佳時間選擇3 d。綜合分析，樟幫枳殼的最佳工藝為A4B2C3，即溫度28℃，時間3 d，相對濕度92%時工藝為佳。

2.1.6 工藝驗證 另取枳殼進行了3批驗證實驗(結果見表7)。說明正交設計篩選出工藝可行。

表7 工藝驗證實驗表

2.2 樟幫枳殼炮制品工藝研究

2.2.1 試驗設計 以樟幫麩炒枳殼工藝為基礎，結合預試驗的情況，采用L16(45)正交表對炮制溫度、炮制時間、麥麩用量三因素設計試驗，每因素設計四個水平，因素水平表見表8。

表8 因素水平表

2.2.2 樟幫枳殼炮制品制備 取樟幫枳殼飲片生品，依照正交設計表L16(45)進行飲片炮制。

2.2.3 柚皮苷、新橙皮苷含量測定 方法與2.1.3項下同，進行柚皮苷、新橙皮苷的含量測定。

2.2.4 色度差測定 取按正交設計表炮制的枳殼飲片5～10片，在CIE規定的標準光源條件下獲取各批飲片外觀的色澤信息(照片文件)。用Adobe Photoshop 9.0分別讀入各批飲片外觀的色澤信息數據(照片文件)，讀取飲片的色澤指標數據 L、a、b值。用色差公式CIEDE 2000計算各批次飲片的色度差。

2.2.5 結果分析 以不同工藝的因素為自變量，柚皮苷含量、新橙皮苷含量標準化值飲片色度差為評判指標，用13.0版SPSS統計軟件進行相關性和方差分析，結果見表9至表11。

表9 方差分析表(n=32)

表10 相關性分析表(n=32)

由表9方差分析表明:A因素、B因素、C因素各水平之間差異具有顯著性(P＜0.05)。表10相關分析表明溫度與柚皮苷含量存在顯著負相關。以含量測定指標最高優，色度差最低優為指標(表11)，最佳溫度以200℃為最佳，最佳時間以120 s為最佳，麥麩用量:柚皮苷最佳依次為10% ＞25%＞15% ＞20%，新橙皮苷最佳依次為10% ＞25% ＞15% ＞20%，色度差最佳依次為20% ＞25% ＞15%＞10%，考慮到麥麩用量為10%時飲片的色度差最大，故選麥麩用量以25%最佳。綜合考慮，麩炒樟幫枳殼的最佳工藝為A3B4C4。即炮制溫度為200℃，麥麩用量為25%，炮制時間為120 s。

表11 變量分析表(n=32)

2.2.6 工藝驗證 另取飲片照優化工藝進行了10批驗證實驗(結果見表12)，說明篩選出的工藝可行。

表12 工藝驗證實驗表

2.3 小結 枳殼苦、辛、酸，微寒。入脾、胃經。生用作用較猛，經麩炒后，減低其刺激性，從而緩和其燥性和酸性，增強其健胃消脹的作用［3］。研究表明，枳殼中所含的柚皮苷和新橙皮苷為其主要活性成分［4］，《中國藥典》2010版規定以高效液相法測定柚皮苷和新橙皮苷的含量作為枳殼藥材的質量控制指標［1］。因此本實驗在用正交設計安排試驗時，選擇柚皮苷和新橙皮苷的含量為考察指標，此外，在樟幫生品制備工藝研究時綜合考查了霉變性狀與成型性，在樟幫麩炒制備工藝研究時將色澤用色度差進行量化，使指標更直觀準確，能較好的考察和控制炮制條件，使所確定的最佳工藝更具有實用價值。

目前對樟幫枳殼的研究，相關文獻報道主要是對其炮制前后的揮發油及成分變化的研究［5－10］，尚未見對樟幫枳殼生品工藝研究的報道?，F采用柚皮苷的含量、新橙皮苷含量、成型性等為考核指標，依照正交設計表L16(45)進行工藝優選，確定樟幫枳殼生品的最佳工藝為:取去內瓤的枳殼，洗凈，潤12 h，壓扁后上木架，置溫度28℃，相對濕度92%的環境中培養3 d，取出，切薄片后干燥。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:171－172.

［2］龔千鋒.中藥炮制學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2003:135.

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