川芎嗪、阿魏酸微透析體外回收率及體內穩定性的研究

王利勝， 石宗豐， 郭 琦， 劉宏偉， 賴寶林

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006)

微透析技術(microdialysis)是一種直接進行組織采樣分析的方法，可通過探針的回收率(recovery)計算組織中藥物的濃度［1］。在國際上已被廣泛應用于動物和人體的研究，其在藥動學研究中特別是局部藥動學中具有其他藥動學方法難以取代的地位，在中藥及其復方研究中則少見相關報道。

阿魏酸(ferulic acid，FA)、川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)分別是當歸、川芎中的主要有效成分，在傳統復方四物湯、佛手散、補陽還五湯等含量較高。TMP是當歸、川芎中的主要活性生物堿，現代研究表明［2］TMP具有擴張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用。FA是川芎中的主要有效成分之一，現代藥理研究證實其在抗氧化、清除自由基、有效抑制血小板聚集和血栓形成等方面具有確切的藥理活性，對大鼠腦缺血再灌注損傷具保護作用［3－4］。本課題組在前期的研究中建立了TMP在小鼠血漿、腦、肝中含量的HPLC法［5］，發現采用微乳這種納米微粒載藥體系可以提高TMP在腦內的分布［6］。在此基礎上開發了復方芎冰微乳，主要含有TMP和FA成分，經過藥理實驗證實，具有良好的保護大鼠腦缺血方面的作用［7］。實驗過程發現傳統的藥動學研究方法往往每一只動物只能獲得一個數據，需要用大批量的實驗動物才能獲得完整的藥時數據，個體差異大。近年來，由于微透析技術可以使用更少的動物數而獲得更加準確的數據信息［8］，其在藥動學領域的研究已成為國內研究的熱點。為了利用微透析取樣技術同時進行中藥及復方中FA、TMP的在體藥動學研究，本實驗初步確定了探針回收率的校正方法及其穩定性，現報道如下:

圖1 阿魏酸、川芎嗪HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of FA/TMP by microdialysis sampling

1 儀器與試藥

1.1 儀器 waters高效液相色譜儀(Waters 515泵，Waters2487檢測器);瑞典CMA402灌注器推進泵、灌注器;MAB7.40.10同心圓型血液探針(截留分子量15 000D);AUW120D十萬分之一分析天平(日本島津)。

1.2 藥物與試劑 阿魏酸、鹽酸川芎嗪對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:110773－200611、110817－200305);川芎嗪 (澤朗植提，含量≥98.5%)。乙腈、水均為色譜級，其他試劑為分析級。

1.3 其他 SD大鼠，SPF級，體重280～320 g(許可證號:SCXK(粵)2008－0020)，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

2 方法與結果

2.1 微透析液中FA、TMP含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 迪馬 platisil ODS柱(5 μm，250 mm×4.6 mm);Phenomenex保護柱;流動相:乙腈－0.5%冰乙酸(36:64);流速1 mL/min，檢測波長為307 nm;外標法定量。

2.1.2 專屬性考察 大鼠麻醉后并植入血液探針，收集空白透析液為空白樣品。平衡1 h后灌流液改為FA/TMP濃度分別為0.54/0.92 μg/mL的含藥林格氏液，并收集血液透析樣品，進樣分析，結果表明透析液中FA、TMP峰形良好，分別在約4.7、6.2 min出峰，分離度及對稱因子均符合要求，可知在本實驗條件下的分析方法具有良好的專屬性。見圖1。

2.1.3 線性關系考察 取五氧化二磷中干燥至恒重的FA、鹽酸川芎嗪對照品，分別精密稱取2.60 mg和3.04 mg(相當于TMP 1.98 mg)，加適量甲醇溶解并用林格氏試液定容至20 mL，再用林格氏試液將其稀釋1 000倍后作為對照品溶液，分別進樣1、4、8、10、15、20 μL 后記錄峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標Y，進樣量為橫坐標X，繪制標準曲線。得FA回歸方程:Y=4.635 8X+143.98，R=1.000 0;TMP回歸方程為:Y=2.335 5X+31.967，R=0.999 9;結果表明，FA進樣量在1.3 ng～26.00 ng范圍內、TMP在0.99～19.8 ng范圍內線性關系良好。

2.1.4 精密度與穩定性試驗 將上述對照品溶液于冷藏(0～4 ℃)、避光條件下儲存，吸取10 μL，連續進樣5次，測得 FA、TMP峰面積 RSD分別為1.17%、1.04%，說明儀器精密度良好;每隔2 h進樣3次并記錄峰面積，結果樣品在8 h內穩定性良好(RSD＜2.5%)。

2.2 微透析試驗

2.2.1 林格氏液及含藥林格氏液的配制 分別稱取 8.599 gNaCl、0.144 gCaCl2、0.298 gKCl溶解于超純水中，并定容至1 000 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得林格氏液。另精密稱取FA、TMP適量，用林格氏液超聲溶解，即得含藥林格氏液。

2.2.2 流速對相對回收率(Relative Recovery，RR)及相對損失率(Relative Loss，RL)的影響 用空白林格氏液在不同流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL/min)灌流置于FA/TMP濃度分別為0.84/0.97 μg/mL的含藥林格氏液的血液探針。每種流速在平衡0.5 h后收集5份樣品(每份樣品30 μL，下同)，HPLC測定接收品濃度Cdialysis和原藥液中藥物濃度Cperfusate，按公式 RR=Cdialysis/Cperfusate×100%(公式1)計算RR;

用FA/TMP濃度分別為0.93/0.95 μg/mL的含藥林格氏液分別在以上流速下灌流置于空白林格氏液中的血液探針，平衡0.5 h后收集5份樣品，接樣的同時取相應一份原藥液，HPLC測定接收品Cdialysis和原藥液中藥物濃度Cperfusate，按公式 RL=(Cperfusate－Cdialysis)/Cperfusate×100%(公式 2)計算RL。

不同流速下FA、TMP的RR及RL結果取平均值，結果見圖2。

結果表明，隨著流速的增加，FA、TMP的回收率呈降低趨勢，RR與RL在各種流速下均基本一致，這為反透析法進行探針回收率校正提供了實驗依據。

圖2 不同流速對FA、TMP的RR、RL影響Fig.2 The effect on RR and RL under different flow rate

2.2.3 藥物濃度對回收率的影響 體內微透析試驗中，探針周圍的藥物濃度是實時變化的，為了保證透析液中藥物濃度變化能正確反映組織中藥物濃度的變化，探針回收率大小必須相對穩定。

將探針分別植入FA/TMP濃度分別為2.51/2.57、1.63/1.55、0.97/1.03、0.48/0.50、0.25/0.24 μg/mL的含藥林格氏液，以空白林格氏液1.5 μL/min流速灌流探針，每種濃度中平衡0.5 h后收集5份樣品，HPLC測定樣品和含藥林格氏液中藥物濃度，按公式1計算回收率，每組取平均值;結果見圖3。

圖3 不同FA、TMP濃度對探針RR的影響Fig.3 The effect on RR under different FA/TMP concentration

結果顯示，當以1.5 μL/min的流速灌注探針時，在5種不同藥物濃度的透析媒體中，所得回收率很接近。以回收率對濃度作圖，結果為一條與x軸大致平行的直線，表明在一定濃度范圍內，探針對FA、TMP的回收率與濃度無關。

2.2.4 體內RL的穩定性考察 由于動物體內的藥物實際濃度是未知的，所以探針真正的體內RR是無從測得的。前面已證明，相同條件下，RR與RL差別不大，說明RL可代替RR進行體內校正。但是，體內微透析試驗持續時間一般較長，同一根探針常常需要連續灌流幾個小時甚至是幾十個小時，如果在長時間的取樣過程中回收率發生變化，就會造成試驗結果的可信度降低。

體內試驗前將探針置肝素鈉注射液中以0.5 μL/min的灌流速度灌流空白林格氏液20 min，使膜內外充分飽和肝素鈉注射液，防止在探針植入過程發生凝血。然后使用FA/TMP濃度分別為0.92/0.96 μg/mL的含藥林格氏液1.5 μL/min流速灌流探針。探針置入方法:SD大鼠，烏拉坦麻醉后鈍性分離頸靜脈，結扎遠心端，并在遠心端剪一小口，將血液探針朝心臟方向植入約2.4 cm，并用縫合線固定探針。平衡1 h后每隔20 min收集一次透析液樣品，灌流10 h，測定含藥林格氏液和透析液樣品中藥物濃度，按公式2計算體內RL。結果見圖4。

圖4 體內回收率的穩定性考察結果Fig.4 The stability of RL in vivo

結果表明，當灌流液流速為1.5 μL/min時，FA、TMP體內RL在10 h內保持相對穩定，血液探針FA體內RL在10 h內平均回收率為49.71%，RSD為5.63%;TMP平均體內RL為65.16%，RSD為2.50%，均具有良好的體內穩定性。

2.2.5 連續使用5次的探針回收率的比較 取新探針用林格氏液以2 μL/min的灌流速度灌流5 h以上，使膜內外平衡、充分浸濕，并沖洗掉半透膜上的一些小分子，備用。取 SD大鼠5只，其余按2.2.4項下實驗方法操作，每只大鼠在平衡1 h后接收5份樣品，測定含藥林格氏液和透析液樣品中藥物濃度，按公式2計算體內RL。結果見表1、表2。

表1 同一探針使用5次的FA回收率變化情況(n=5)Tab.1 The variation of RR of FA in 5 times in one probe(n=5)

表2 同一探針使用5次的TMP回收率變化情況(n=5)Tab.2 The variation of RR of TMP in 5 times in one probe(n=5)

實驗表明，同一只探針在使用5次后依然可以保持較高的回收率，但各次之間回收率波動較大，說明在每次實驗后均需進行體內校正。

3 討論

微透析技術是將灌流取樣和透析技術結合起來并逐漸完善的一種新型生物采樣技術，相對于其他生物取樣技術，微透析技術具有以下幾個方面獨特的優勢［9］:①其最大的優點是可在基本上不干擾體內正常生命過程的情況下進行在體、實時和在線取樣，特別適用于研究生命過程的動態變化;②微透析技術不改變細胞外液(ECF)中的液體平衡，既可以對同一組織進行長時間連續采樣，也可以對同一動物進行多個部位采樣，因此，用較少的實驗動物就可以得到足夠的數據，避免了由于動物的個體差異所造成的實驗誤差;③由于微透析技術只允許小分子物質通過半透膜，大分子的蛋白、脂質類物質不隨透析液進入檢測裝置，所得樣品干凈，可以直接進行樣品分析，省去了繁瑣的樣品前處理步驟;④微透析技術可以直接對ECF中的物質分析，與采血取樣技術相比，藥物在ECF中的濃度與其藥理或毒理作用的相關性更大。

在微透析取樣過程中，組織中物質在探針透析膜內外的分布處于一種動態平衡中，但是由于探針持續灌流的溶液，導致了藥物在組織液和灌注液之間的擴散不能達到絕對的平衡，透析液中的藥物含量只是ECF中的一部分，要低于探針外細胞間的待測物的濃度。因此，在應用微透析技術進行藥物藥動學研究之前必須要考察微透析探針對所研究藥物的回收率。而探針回收率的準確校正是測定生物體中待測組分確切濃度的一個關鍵問題［10］，回收率的高低受到探針型號、待測物質的性質、灌流液的性質、流速等很多因素的影響。目前，探針回收率的校正方法也有多種［11］，包括零凈流量法、反向透析法、外推至零流速法等。其中，反透析法是通過測定藥物經過半透膜時的流失量即探針對藥物的相對損失率(RL)來間接計算探針的回收率，該法與零凈通量法都是進行體內探針校正十分準確可靠的方法，但反透析法相對更簡單易行、省時［12］。應用反透析法校正微透析探針回收率的前提條件是探針的RR和RL相等，而探針對藥物的相對回收率和相對損失率是否相等與藥物本身的性質有關，反透析法并非適用于所有藥物。本實驗通過體外回收率的研究，驗證了所使用的微透析探針回收率與濃度無關性，這是利用微透析技術測定細胞外液中藥物真實濃度的前提條件;考察的結果表明TMP、FA的探針回收率與損失率具有一致性，驗證了反透析法測定藥物體內回收率的可行性及合理性，可以以此來推斷組織中的實際藥物濃度。

中藥復方中藥效成分多樣，且理化性質各異，能否將微透析法用于復方的藥動學研究，首先要確定各種不同成分探針回收率的矯正方法。本實驗擬將微透析技術應用到中藥復方藥動學研究中，通過體內、外實驗方法探討使用微透析法進行中藥復方藥動學研究的可行性，確定了體內可通過反透析法進行FA、TMP的回收率測定。本文的研究結果為微透析法技術用于FA、TMP的體內藥動學研究提供了實驗依據和方法支持。

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