參參康心膠囊對(duì)小鼠缺血心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)及Na+、Mg2+、Ca2+含量的影響

劉喜平， 李沛清， 劉 勍， 吳紅彥

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000;2.天水師范學(xué)院，甘肅天水 741000)

新藥參參康心膠囊源于名老中醫(yī)驗(yàn)方，由水蛭等三味藥物組成，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝加工而成，臨床應(yīng)用多年，對(duì)冠心病、心肌梗死等心肌損傷性疾病有顯著療效，以往研究表明該制劑可減輕阿霉素(ADR)心肌毒性［1］及垂體后葉素(Pit)所致心肌損傷，其作用機(jī)理與抗氧化，清除氧自由基、調(diào)節(jié)ATP酶活性有關(guān)［2］，本文進(jìn)一步探討了參參康心膠囊對(duì)小鼠缺血心肌超微結(jié)構(gòu)及心肌線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量的影響，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種普通級(jí)健康小鼠，♀♂各半，體重(30.0±2.0)g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第 14－005。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 參參康心膠囊:處方由水蛭等三味藥物按一定的比例組成。由蘭州中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)中心及甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心監(jiān)制，規(guī)格為每粒0.5 g(每粒相當(dāng)于生藥1 g)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水溶解為120 mg生藥/mL。地奧心血康膠囊:成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào):0503079代號(hào)022，國(guó)藥準(zhǔn)字:Z10910051。

1.3 試劑及儀器 勻漿介質(zhì)，參考文獻(xiàn)法［2］配制備用。52羥葵酸(美國(guó)sigma公司)。電子天平(Sartorius BL150，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);離心機(jī)(D－37520，德國(guó));數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH－4，鄭州杜甫儀器廠);紫外分光光度計(jì)(UV－9100，北京瑞利分析儀器公司);透射電鏡:規(guī)格型號(hào):JEM－1230，日本產(chǎn)。CCD相機(jī):美國(guó)GATAN公司產(chǎn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(地奧心血康組)、心肌缺血模型+參參康心膠囊(小劑量組、中劑量組、大劑量組)，每組10只。參參康心膠囊劑量按50 kg成人常規(guī)劑量折算后作為中劑量組(3 g生藥/kg體重)，高劑量組為中劑量組放大一倍(6 g生藥/kg體重)，小劑量組為中劑量組縮小一倍(1.5 g生藥/kg體重)。各劑量組每天灌胃2次，空白對(duì)照組及模型組每日給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)5 d，陽(yáng)性對(duì)照組按0.076 g/kg，1 mL/次灌胃。模型組及各用藥組小鼠在第5天灌胃30 min后腹腔注射Pit(劑量30 u/kg體重)［3］，空白對(duì)照組第5天腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2 線粒體的分離 頸椎脫臼處死，取出心臟稱重，用冰冷的生理鹽水制成勻漿，4℃ 2 000 r/min離心10 min，取上清液，將此上清液再4℃ 10 000 r/min離心15 min，沉淀為線粒體，沉淀用20倍的冰冷勻漿介質(zhì)制備成混懸液［4］。

2.3 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察 動(dòng)物分組、復(fù)制模型方法同上，注射Pit15 min后，參考文獻(xiàn)方法［5］，將手術(shù)摘取的心臟剪去心房部，在冰的磷酸緩沖液中洗去血液，切成小塊(1 mm3)，分別置于3%戊二醛中固定。按電鏡常規(guī)制作方法將切成小塊的心肌組織在1/15 mol的磷酸緩沖液中漂洗3次，每次10 min;漂洗后用1%鋨酸固定1 h 20 min;再次用1/15 mol的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10 min;逐級(jí)用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇脫水各 10 min;后用100%丙酮脫水10 min;以1∶1的比例用包埋劑EPON包埋浸透2 h;在35℃、45℃、60℃條件下各聚合24 h;用超薄切片機(jī)切片，厚度為60～80 nm;用飽和醋酸鈉及枸櫞酸鉛雙染色(雙染法)透射電鏡觀察與攝片。

2.4 線粒體的形態(tài)計(jì)量分析 參考文獻(xiàn)方法［6］，每只小鼠觀察2個(gè)銅網(wǎng)，每個(gè)銅網(wǎng)照2張底片，放大倍數(shù)均為20 000倍。各組電鏡底片應(yīng)用HPIAS－1000圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)計(jì)量分析，計(jì)算線粒體的體密度(即線粒體體積與胞質(zhì)體積的比值)、比表面(線粒體外膜面積與線粒體體積之比)、面數(shù)密度(參照系截面單位內(nèi)的顆粒數(shù)目)。

2.5 心肌線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量的測(cè)定 取少量線粒體沉淀用硝酸消化后，用原子吸收分光光度儀測(cè)定其鈉、鈣、鎂含量。其吸收量與含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較進(jìn)行定量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)，用t檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變 結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)透射電鏡觀察，空白對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)正常，粗細(xì)肌絲排列整齊有序，清晰完整，肌節(jié)整齊，線粒體大小形態(tài)正常，內(nèi)部嵴排列有序，結(jié)構(gòu)清晰完整可見(jiàn);模型組肌絲排列疏松，肌節(jié)不清晰，不完整，有明顯的肌絲融合，形成多處肌融灶線粒體不完整，有多處腫脹破裂，線粒體嵴模糊，斷裂融合，形成空泡;陽(yáng)性對(duì)照組顯示肌節(jié)整齊，肌絲無(wú)疏松現(xiàn)象，線粒體致密呈凝聚狀，線粒體嵴結(jié)構(gòu)不清晰，排列致密;小劑量組肌絲輕度疏松，但肌節(jié)基本整齊，線粒體較完整，線粒體嵴排列結(jié)構(gòu)尚清晰完整;中劑量組和大劑量組均顯現(xiàn)肌節(jié)整齊，肌絲排列有序，肌膜平整，其中，中劑量組線粒體大小形態(tài)較正常，無(wú)腫大表現(xiàn)，嵴結(jié)構(gòu)基本清晰完整;大劑量組線粒體大小形態(tài)正常，線粒體嵴排列基本有序，結(jié)構(gòu)清晰。

圖1 小鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變

3.2 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)計(jì)量分析 結(jié)果見(jiàn)表1。模型組體密度明顯增大，面數(shù)密度、比表面均減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，各用藥組體密度均減少，面數(shù)密度、比表面均增大，參參康心膠囊大劑量組作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而參參康心膠囊小、中劑量組與陽(yáng)性組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)計(jì)量分析結(jié)果(± s，n=40)

表1 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)計(jì)量分析結(jié)果(± s，n=40)

注:與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.01。

組別 體密度/% 面數(shù)密度/μm－2 比表面/μm －1空白組32.79±5.54 0.871±0.150 32.75±7.23模型組 48.65±8.64* 0.791±0.119 25.57±7.30*小劑量組 37.82±5.83 0.741±0.098* 28.12±4.15*中劑量組 35.84±7.31* 0.776±0.112* 27.84±4.41*△大劑量組 34.28±6.53*△ 0.837±0.121* 32.55±6.65△陽(yáng)性組 36.74±6.31* 0.790±0.123* 28.90±4.35*△

3.3 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量 結(jié)果見(jiàn)表2。模型組的線粒體Na+與Ca2+濃度高于空白組，Mg2+濃度低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。參參康心膠囊各組及陽(yáng)性對(duì)照組Na+與Ca2+濃度均低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);Mg2+濃度則高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，參參康心膠囊大劑量與中、小劑量間有劑量－效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05);參參康心膠囊中、小劑量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量(± s，n=10)

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量(± s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與空白組比較，▲P＜0.01。

組別 Na+/(μg/mg) Mg2+/(μg/mg) Ca2+/(μg/mg)空白組15.48±4.25 14.38±3.35 2.01±0.56模型組 24.57±5.86▲ 8.85±2.68▲ 2.86±0.27▲小劑量組 24.35±4.18 9.43±2.64* 2.34±0.48*中劑量組 23.49±5.25* 10.21±2.98* 2.31±0.54*大劑量組 21.25±3.83△ 13.23±3.97△ 2.17±0.51△陽(yáng)性組 23.26±5.36* 10.59±4.21△ 2.67±0.42*

4 討論

心肌缺血屬中醫(yī)“胸痹”、“心痛”范疇。中醫(yī)認(rèn)為該病以本虛標(biāo)實(shí)為其病理特征。本虛責(zé)之于氣、血、陰、陽(yáng)不足，以心氣不足最為突出，標(biāo)實(shí)主要涉及氣滯、血瘀、痰飲、寒凝、火熱等病理產(chǎn)物或因素，以心絡(luò)瘀阻為主。故氣虛血瘀是心肌缺血性疾病的主要發(fā)病機(jī)制，故以益氣養(yǎng)心，活血通絡(luò)為防治心肌缺血性疾病的基本治法。參參康心膠囊組方嚴(yán)謹(jǐn)，藥少力專，功能益氣養(yǎng)心，活血通絡(luò)，使氣旺促血行，祛瘀而不傷正。垂體后葉素收縮冠狀動(dòng)脈，導(dǎo)致心肌供血不足，收縮全身小血管，導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，常用于誘導(dǎo)心氣虛證動(dòng)物模型［7］，本研究選用該模型作為心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

線粒體是維持機(jī)體細(xì)胞氧化及能量產(chǎn)生的重要功能單位，是一種膜性細(xì)胞器，其重要的生物學(xué)功能是氧化代謝和鈣代謝。線粒體對(duì)缺血、缺氧十分敏感，是清除氧自由基酶系統(tǒng)活力最重要的部位和決定細(xì)胞由可逆到不可逆改變的關(guān)鍵細(xì)胞器［8］。本實(shí)驗(yàn)觀察到參參康心膠囊干預(yù)后心肌線粒體肌節(jié)整齊，肌絲排列有序，肌膜平整線粒體大小形態(tài)較正常，無(wú)腫大表現(xiàn)，嵴結(jié)構(gòu)清晰完整。從形態(tài)學(xué)方面證實(shí)了參參康心膠囊保護(hù)缺血心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)與功能。

心肌缺血時(shí)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)外Ca2+分布的失衡，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌缺血損傷的特征之一。線粒體對(duì)鈣離子的攝取主要是通過(guò)線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電位差和鈣離子濃度差的驅(qū)動(dòng)下完成，屬耗能過(guò)程，對(duì)維持胞質(zhì)鈣濃度的穩(wěn)定有重要的意義。在缺血缺氧線粒體內(nèi)膜一方面要攝取胞質(zhì)超載的鈣離子，一方面要利用膜兩側(cè)的電位差合成ATP。在心肌缺血和缺氧的情況下，由于Na+K+－ATP酶被抑制，細(xì)胞內(nèi)Na+也發(fā)生積聚，繼而發(fā)生Ca2+超載。本研究顯示:心肌缺血時(shí)，線粒體中鈉、鈣、鎂的含量出現(xiàn)不同程度的改變。Mg2+含量的減少，Na+、Ca2+含量增多，從而加重了能量代謝障礙。這與我們以往研究參參康心膠囊顯著提高Na+K+－ATP酶活性完全一致［2］。

線粒體的體密度為參考系統(tǒng)中線粒體所占的百分?jǐn)?shù)，線粒體的面數(shù)密度是指單位參考系統(tǒng)中線粒體的數(shù)目，比表面是反映結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系最重要的形態(tài)參數(shù)。在相同表面積情況下，體積越大，比表面越小，反之體積越小，比表面越大，在相同體積情況下，球的比表面最小。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血后，心肌線粒體等超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，其體密度明顯增大，而面數(shù)密度、比表面顯著減少，表明線粒體高度水腫，數(shù)量減少，線粒體膜及基本結(jié)構(gòu)發(fā)生病變。從形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量結(jié)果來(lái)看，模型組體密度最大，面數(shù)密度、比表面最小，提示此組線粒體水腫最嚴(yán)重，超微結(jié)構(gòu)的破壞也以模型組最重，與線粒體變化一致，而各用藥組較模型組體密度減少，面數(shù)密度、比表面增大，心肌損傷程度也較輕，參參康心膠囊各組可減輕缺血造成的心肌線粒體水腫，阻止缺血心肌膜損傷，維持膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)，尤以參參康心膠囊大劑量組作用明顯。

［1］吳紅彥，張建剛，劉永琦，等.參參康心膠囊抗阿霉素心肌毒性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(3):18－19.

［2］李沛清，王 燕，劉喜平，等.參參康心膠囊對(duì)缺血小鼠心肌線粒體損傷的保護(hù)作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35(1):19－21.

［3］趙明奇，劉 艷，趙丹洋，等.通心絡(luò)改善缺血心肌供血的NO機(jī)制研究［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(6):43－45.

［4］斯佩克特.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:20.

［5］吳建新，王一心，鈕榮祥，等.心脈龍對(duì)大鼠異丙腎上腺素性缺血心肌的保護(hù)作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2002，18(1):97－98.

［6］李艷茹，彭 力，馬海英，等.非酶糖基化致衰老小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)和線粒體形態(tài)計(jì)量改變的研究［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，2002，21(5):529－530.

［7］李紹芝，朱文鋒，黃獻(xiàn)平，等.心氣虛證動(dòng)物模型的研制［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(7):466－471.

［8］雷 厲.大鼠缺血心肌線粒體損傷及其意義［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，36(1):9－12.