抗瘤中藥調變結直腸癌細胞免疫抑制分子分泌的比較研究

李保紅 崔澂 高峰 王潤田 鄭文廣 張征崢

結直腸癌是目前世界上發病率和病死率較高的惡性腫瘤之一。通過分泌轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、IL-4、IL-6、IL-10、PGE2 等免疫抑制分子抑制免疫功能從而逃避免疫監視，是結直腸癌發生發展的重要機制［1－3］。目前應用于結直腸癌的放、化療藥物多具有一定的不良反應，尤其是對免疫功能已顯低下的患者，可致全身及腫瘤局部免疫功能進一步損傷。抗瘤中藥制劑具有低毒、不對機體免疫系統造成損傷的特點，恰可彌補放、化療在臨床使用中的不足［4，5］。對其影響腫瘤免疫抑制分子分泌的研究，除本課題組外筆者尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞株 小鼠結直腸癌細胞株Colon 26，為中國人民解放軍白求恩軍醫學院訓練部凍存。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI-1640為GIBCO公司產品，每升完全培養液(Complete Medium，CM)中含小牛血清0.1 L、青霉素100000 U、鏈霉素100 mg;小牛血清由河北醫科大學科技總公司提供，青霉素及鏈霉素為華北制藥集團產品;MTT及DMSO 為美國 Sigma公司產品。TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6、IL-10 酶聯免疫檢測試劑盒均為美國R＆D公司產品;PGE2檢測試劑盒為上海陽光生物制品公司產品。Mk353型酶聯免疫檢測儀為芬蘭ThermoLabsystems產品。

6種中藥制劑:亞砷酸注射液為哈爾濱伊達藥業有限公司產品，批號20040201，10 mg/10 ml，主要成分為三氧化二砷(As2O3)。鹽酸川芎嗪(LHC)注射液為北京市永康藥業有限公司產品，國藥準字H 11020960，40 mg/2 ml。黃芪(AMB)注射液為成都地奧九泓制藥廠產品，國藥準字Z 51021776，20 g/10 ml。苦參素注射液為天津市生物化學制藥廠產品，國藥準字 H 12020506，0.2 g/2 ml，主要成分為氧化苦參堿(MOX)。豬苓多糖(PUPS)注射液為江蘇正大天晴藥業股份有限公司產品，ZZ-5458蘇衛藥準字(1999)第185701號，20 mg/2 ml。青蒿琥酯(ART)注射液為桂林南藥股份有限公司產品，國藥準字H 10930195，60 mg/瓶，以1 ml 5%NaHCO3溶解。所有中藥制劑實驗前均用CM稀釋至所需濃度。

1.3 中藥制劑作用濃度的確定 取對數生長期Colon 26細胞加入96孔板，再分別加入系列稀釋的各種中藥制劑;使腫瘤細胞終濃度為2×108/L，6種中藥制劑的終濃度參見表1;設立無中藥的單純腫瘤細胞對照孔(Control);一式三復孔，混勻后置37℃ 5%CO2飽和濕度中培養48 h，MTT法檢測A492值。選取對腫瘤細胞生長增殖無影響的中藥制劑最高濃度作為實驗用濃度。

表1 實驗中6種抗瘤中藥制劑的系列稀釋濃度

1.4 中藥制劑作用及作用后傳代的Colon 26再培養上清的制備 取對數生長期Colon 26細胞，分別用含和不含確定濃度的不同中藥制劑的CM懸至2×108/L，培養48 h后離心棄上清，收集的細胞洗滌后，以CM重懸至初始濃度(2×108/L)，培養48 h;離心收集的上清即分別為藥物作用后的Colon 26第一次再培養上清(As-S1、LHC-S1、AMB-S1、MOX-S1、PUPS-S1、ARTS1)和未經藥物作用同步培養的相應對照上清(Control-S1)。細胞再以CM重懸至初始濃度，再培養48 h;離心收集的上清即分別為藥物作用后的Colon 26第2次再培養上清(As-S2、LHC-S2、AMB-S2、MOX-S2、PUPS-S2、ART-S2)和未經藥物作用同步培養的相應對照上清(Control-S2)。細胞均用臺盼藍染色進行活細胞計數顯示無差異。

1.5 Colon 26再培養上清中6種免疫抑制分子含量的檢測TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6、IL-10、PGE2 定量檢測采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。嚴格按照試劑盒說明書操作，最后以酶聯免疫檢測儀測定A 492值;分別以系列稀釋的相應標準品所檢測的A 492值與標準品濃度對數值進行直線回歸分析，根據直線回歸方程得出各種待測上清中6種免疫抑制分子的含量。

1.6 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，對所得結果進行方差分析齊性檢驗后，進行成組設計兩樣本均數比較的t或t’檢驗、單因素相關分析;采用F檢驗進行單因素方差分析(ANOVA)，q檢驗進一步對多個樣本均數間進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗用中藥制劑濃度的確定 與對照組比較，As2O3、LHC、AMB、MOX、PUPS和ART分別作用于終濃度為2×108/L的Colon 26細胞48 h后，MTT法檢測A492值差異無統計學意義(均 P ＞ 0.05)的最高濃度分別為 0.5 mg/L、6 mg/L、250 g/L、0.3 g/L、125 mg/L、6.25 mg/L，即對 Colon 26 細胞無直接毒性作用的中藥制劑最高濃度，確定為實驗用濃度。分別經確定濃度的不同中藥制劑作用48 h及作用后連續2次48 h再培養的Colon 26細胞，活細胞計數與對照組相比差異無統計學意義(P均＞0.05)。見表2。

表2 不同濃度的抗瘤中藥制劑對Colon 26增殖的影響n=10，

表2 不同濃度的抗瘤中藥制劑對Colon 26增殖的影響n=10，

注:與對照組 (1.084 ±0.111)比較，*P ＜0.05

中藥制劑7個系列的稀釋濃度1234567 As2O3(mg/L) 0.440 ±0.050* 0.518 ±0.068* 0.790 ±0.105* 0.840 ±0.068* 0.920 ±0.073*1.059 ±0.080 1.052 ±0.093 LHC(mg/L) 0.073 ±0.013* 0.675 ±0.060* 0.833 ±0.075* 0.919 ±0.083* 0.949 ±0.100* 1.063 ±0.092 1.055 ±0.105 AMB(g/L) 0.337 ±0.033* 0.793 ±0.129* 1.030 ±0.076 1.014 ±0.081 1.015 ±0.076 1.025 ±0.074 1.056 ±0.067 MOX(g/L) 0.078 ±0.009* 0.317 ±0.051* 0.521 ±0.061* 0.804 ±0.059* 0.895 ±0.068* 1.034 ±0.067 1.027 ±0.068 PUPS(mg/L) 0.765 ±0.066* 0.931 ±0.082* 0.952 ±0.097* 0.998 ±0.089* 1.017 ±0.094* 1.065 ±0.091 1.095 ±0.115 ART(mg/L) 0.218 ±0.040* 0.607 ±0.064* 0.890 ±0.099* 0.976 ±0.088* 1.031 ±0.098*1.060 ±0.094 1.084 ±0.108

2.2 中藥制劑影響Colon 26免疫抑制分子分泌的比較分析6種中藥制劑對 TGF-β1的影響有差別(F=425.699，P=0.000)，As2O3、MOX及ART作用后初始下調幅度差異無統計學意義(下調約25%，P均＞0.05)，LHC、AMB及PUPS作用后初始下調幅度有顯著差異(分別下調約45%、50%和33%，均P=0.000);AMB的初始及持續下調幅度、維持時間均最顯著，下調作用最強。對IL-6的影響差異有統計學意義(F=11.852，P=0.000)，AMB、MOX、PUPS 及 ART 作用后對 IL-6的分泌無影響或發揮上調作用;As2O3、LHC的下調幅度均約5%，但作用時相不同。對IL-10的影響差異有統計學意義(F=3.587，P=0.023)，除 PUPS 作用后可使 IL-10 上調約 2%外，其他5種中藥制劑均可下調約5%左右;As2O3的初始及持續下調幅度、維持時間均最顯著，下調作用最強。對PGE2的影響差異無統計學意義(F=2.587，P=0.063)，除 As2O3可延遲出現下調外，其他5種中藥制劑均顯示上調作用。對VEGF及IL-4的影響之間差異無統計學意義(分別為F=0.598，P=0.727;F=2.559，P=0.069)。見表3。

表3 中藥制劑作用后Colon 26再培養上清中免疫抑制分子的含量變化n=3，pg/ml，

表3 中藥制劑作用后Colon 26再培養上清中免疫抑制分子的含量變化n=3，pg/ml，

注:與 Control-S1 比較，*P ＜0.05;分別與 As-S1、LHC-S1、AMB-S1、MOX-S1、PUPS-S1、ART-S1 比較，#P ＜0.05;與 Control-S2 比較，△P ＜0.05

VEGF IL-4 IL-6 IL-10 PGE2 Control-S1 1295 ±30 29.18 ±1.90 27.70 ±0.70 26上清組別 TGF-β1.55 ±0.60 29.52 ±2.50 9.69 ±0.42 Control-S2 1266 ±20 29.30 ±1.80 27.65 ±1.70 26.63 ±1.00 29.63 ±1.90 9.71 ±0.44 As-S1 996 ±17* 28.25 ±0.14 27.01 ±0.13* 26.22 ±0.18 27.35 ±0.11* 26.33 ±0.25*As-S2 1026 ±19#△ 30.16 ±0.17 27.54 ±0.10# 25.56 ±0.09#△ 27.70 ±0.23△ 8.91 ±0.20#△LHC-S1 725 ±6* 28.56 ±2.11 28.12 ±0.22 25.24 ±0.78* 28.23 ±0.45* 27.04 ±0.66*LHC-S2 984 ±8#△ 29.23 ±0.86 27.47 ±0.56 26.58 ±0.34# 27.49 ±0.42#△ 25.78 ±0.25#△AMB-S1 640 ±5* 29.70 ±0.86 27.73 ±0.58 28.69 ±0.37* 27.99 ±0.61* 24.88 ±0.16*AMB-S2 561 ±5#△ 30.59 ±1.09 28.47 ±0.52 27.03 ±0.46# 29.68 ±0.30# 19.37 ±0.11#△MOX-S1 988 ±36* 29.31 ±2.04 28.54 ±0.52 26.38 ±0.59 28.21 ±0.64* 21.48 ±0.20*MOX-S2 627 ±6#△ 33.48 ±1.43#△ 29.46 ±0.63 26.49 ±0.37 28.13 ±0.51△ 12.19 ±0.18#△PUPS-S1 870 ±5* 28.09 ±1.27 27.90 ±0.14 26.81 ±0.66 30.04 ±0.45 28.06 ±0.32*PUPS-S2 949 ±8#△ 30.48 ±0.67#△ 29.98 ±0.34#△ 29.65 ±0.40#△ 31.85 ±0.88#△ 17.47 ±0.14#△ART-S1 988 ±7* 27.94 ±0.27 27.11 ±0.20 27.96 ±0.23 27.67 ±0.24* 30.72 ±0.74*ART-S2 668 ±6#△ 30.05 ±0.23 29.34 ±0.21#△ 28.79 ±0.19#△ 28.03 ±0.21△ 19.98 ±0.43#△

3 討論

本研究發現，2×105/ml Colon 26分別經確定濃度的6種中藥制劑作用48 h，及作用后徹底洗去中藥制劑再行48 h傳代培養，其活細胞計數與未經中藥制劑作用同步對照培養的Colon 26差異無統計學意義(P＞0.05)。表明中藥制劑作用后Colon 26細胞再培養上清中免疫抑制分子含量的變化，確系由中藥制劑影響了Colon 26免疫抑制分子的分泌，而非改變腫瘤細胞的增殖存活狀態所致。

本實驗結果顯示，Colon 26腫瘤細胞可分泌所測的6種免疫抑制分子，其中TGF-β1含量最高，可達(1295±30)pg/ml;6種中藥制劑作用后，可分別調變免疫抑制分子分泌，并呈現差異性、多效性和重疊性。不同類別中藥制劑影響分泌的種類、程度、出現及維持時間迥異，提示可能由于其有效成分及藥理作用特點的差異，導致對結直腸癌細胞分泌免疫抑制分子的影響具各自不同的譜系特征;不同中藥制劑對同一免疫抑制分子分泌的影響程度相同，可能是由于不同中藥制劑的有效成分所發揮的效應相似所致。因此，下調腫瘤細胞免疫抑制分子的分泌，也應是中藥制劑發揮抗瘤效應的機制之一。

目前已知的腫瘤免疫抑制分子中，TGF-β1的免疫抑制作用最強，受抑制的免疫細胞種類較廣，且多種惡性腫瘤組織中TGF-β1蛋白及其mRNA表達異常增高，與腫瘤的分化、浸潤、淋巴轉移、TNM分級等有關，同時還與患者的短生存期及不良預后密切相關，直接影響臨床抗瘤療效［6－10］。本實驗結果顯示，在發生下調的免疫抑制分子中，以TGF-β1基礎含量最高，降低幅度最大，下調幅度最高可達55.75%，且發揮下調效應的中藥制劑種類最多，AMB、MOX、As2O3等對Colon 26腫瘤細胞分泌TGF-β1均具有強而持久的阻抑作用;而其他免疫抑制分子的基礎含量偏低，降低幅度均較小，下調幅度最高僅7.35%，且針對其發揮下調效應的中藥制劑種類多少不一。因此推測，TGF-β1是結直腸癌細胞分泌的優勢免疫抑制分子，是各種中藥制劑下調免疫抑制的重要靶分子;其它免疫抑制分子含量雖然也發生了變化，但可能并未發揮主導作用。

針對中醫有關熱毒內蘊、氣滯血瘀、痰濕凝聚、正氣虛弱的腫瘤病機，抗瘤中藥制劑可分別通過以毒攻毒、清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結、化痰祛濕、扶正祛邪等作用發揮效應。本文所選用的6種抗瘤中藥制劑，As2O3屬以毒攻毒類、MOX及ART屬清熱解毒類、LHC屬活血化瘀類、PUPS屬軟堅散結及化痰祛濕類、AMB屬扶正祛邪類。中醫理論講究辨證施治，即在全面分析病情及患者整體免疫狀況的基礎上，提倡多靶點聯合用藥、組合性個體化方案設計。本實驗結果顯示，AMB對結直腸癌細胞分泌TGF-β1的下調作用最強，As2O3對其他5種免疫抑制分子分泌的下調效應較顯著;提示，臨床可考慮聯合使用扶正祛邪類(例如黃芪制劑)及以毒攻毒類(例如砷制劑)抗瘤藥物組方，或許可較全面地調整患者不利于臨床治療的免疫抑制分子分泌狀態。

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