α-玉米赤霉醇對轉APP基因小鼠的影響

潘高峰 毛善平 張 乾 董慧敏 嚴明敏 付志平 李 燕

自上世紀90年代初以來,雌激素在防治阿爾茨海默病(A lzheimer's disease,AD)的作用就一直受到人們的關注,但是雌激素易誘發乳腺癌、子宮內膜癌及靜脈血栓等副作用,因此限制了雌激素在防治AD中的臨床應用。植物雌激素是從植物當中發現的具有雌激素樣作用的物質,與雌激素相比更安全,例如白藜蘆醇、大豆異黃酮及亞麻木酚素等。α-玉米赤霉醇是一種新型的植物雌激素,為一種選擇性雌激素受體調節劑,同時具有雌激素樣效應和抗雌激素樣效應[1-4],其在防治AD方面尚未見相關報道。本實驗應用轉APP基因構建AD小鼠模型,應用α-ZAL治療后,觀察小鼠的行為學改變以及血清和腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醇(MDA)含量,以明確α-ZA L在防治阿爾茨海默病的作用以及作用機制,為臨床應用α-ZAL防治AD提供實驗依據。

1 實驗資料

1.1 試劑與藥物 α-ZA L(純度≥98%)購買自sigma公司,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗儀器 M orris水迷宮購自中國醫學科學院藥物研究所,UV-7501紫外分光光度儀購自無錫科達儀器廠,RT-1904C生化分析儀由深圳雷杜科技有限公司提供

1.3 實驗動物 9月齡轉APP基因小鼠14只,體重(50±5)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司(質量合格證號：0187171,使用證號：00014980),9月齡健康與轉APP基因小鼠遺傳背景相同的C57BL/6J系正常小鼠7只,體重(50±5)g,北京華阜康生物科技股份有限公司(質量合格證號：0203284,使用合格證號：00014980)。

1.4 動物分組及給藥 9月齡轉APP基因小鼠按照體重、性別和M orris水迷宮測試成績分層后隨即分為2組：模型組、α-ZAL治療組,每組7只,另選7只9月齡健康與轉APP基因小鼠遺傳背景相同的C57BL/6系正常小鼠按性別、體重及M orris水迷宮測試成績組成正常對照組。α-ZA L治療組從9月齡開始時分別灌胃給予溶于植物油的α-ZA L 1.0 mg?(kg-1?d-1,連續40天 。模型組和對照組灌胃等量的植物油連續40 d。

1.5 試驗 水迷宮由圓形水池、圖像采集系統以及操作分析系統組成。水池直徑150 cm,高45 cm,水深32 cm。在一個象限內放置1個直徑為5.5 cm,高30 cm的平臺,水溫保持在25℃左右,平臺、水、池壁均染黑以隱蔽平臺,水池周圍有固定的參照線索供小鼠定位平臺。攝像機裝于水池上方約3 m處,并與監視器和計算機相連。(1)定位航行實驗：給藥40 d后開始檢測3組動物隱匿平臺逃避潛伏期。實驗歷時5 d,隨機從4個不同象限入水,記錄小鼠從入水至爬上平臺的時間,即隱匿平臺逃避潛伏期。爬上平臺后停留10 s,超過60 s的記為60 s,每天進行1次。隱匿平臺逃避潛伏期反映空間學習記憶能力;(2)空間探索實驗：第6 d上午撤出平臺,將小鼠隨機從某一象限池壁中點面向池壁放入水中,記錄60 s內穿越平臺部位的次數。

1.6 血清和腦組織中SOD、GSH-PX活力和MDA含量的測定 各組小鼠脫頸處死,眼球取血,離心(3 000 r/min,10 min),分離血清置4℃備用;斷頭摘全腦以冰冷生理鹽水清理血跡,用濾紙吸干,稱質量,加入19倍冰冷生理鹽水手動制成5%腦勻漿,離心(2 500 r/m in,10 m in),取上清液置4℃備用。GSH-PX、SOD活力和MDA含量測定應用自動生化分析儀和紫外分光光度計嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 統計學處理采用SPSS16.0軟件。計量資料數據采用均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為有顯著性差異,有統計學意義。

2 結 果

2.1 α-ZA L對轉APP基因小鼠空間學習記憶能力的影響

2.1.1 定位航行試驗 3組小鼠從水迷宮訓練第1 d開始,模型組的逃避潛伏期較正常對照組明顯延長(P＜0.01),且隨著訓練天數的延長差異更趨于穩定。α-ZA L治療組與模型組隨著時間推移可見有明顯差異(P＜0.05),尤其在第4d開始就有顯著性差異(P＜0.01)。3組小鼠隨著訓練次數增多,尋找平臺的時間也在縮短,說明學習鍛煉可以增強空間學習記憶能力,但各組小鼠的空間學習記憶能力有差異(表1)。

表1 3組逃避潛伏期變化(±s,s)

表1 3組逃避潛伏期變化(±s,s)

注：與正常對照組比較﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01;與模型組比較﹟P＜0.05,﹟﹟P＜0.01

組別逃避潛伏期第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 第5 d模型組 57.29±3.75﹡﹡ 46.12±5.29﹡﹡ 37.49±6.01﹡﹡ 32.23±5.66﹡﹡ 27.23±6.76﹡﹡α-ZAL治療組 47.21±7.45 34.53±7.27﹟ 25.04±8.32﹟ 18.29±7.36﹟﹟ 13.35±6.06﹟﹟正常對照組 42.93±5.79 29.56±3.41 19.76±6.03 14.40±4.67 8.16±2.62

2.1.2 空間探索實驗 模型組與正常對照組之間比較差別有顯著性差異(P＜0.05),α-ZAL治療組與模型組之間穿越平臺的次數比較差別有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。

表2 3組空間探索實驗結果比較(±s,s)

表2 3組空間探索實驗結果比較(±s,s)

注：與正常對照組比較,﹡P＜0.05;與模型組比較,﹟P＜0.05

組別 只數 60 s越平臺的次數模型組 7 1.71±0.76﹡α-ZA L治療組 7 3.86±1.07﹟正常對照組 7 4.43±1.13

2.2 小鼠血清中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的測定 α-ZAL治療組SOD、GSH-PX活性明顯高于模型組,MDA含量明顯低于模型組,均有顯著性差異(P＜0.01)。正常對照組SOD、GSH-PX活性明顯高于模型組,MDA含量明顯低于模型組,差別有高度顯著性差異(P＜0.01)(表3)。

表3 3組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

表3 3組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

注：與正常對照組比較﹡P＜0.01;與模型組比較﹟P＜0.01

組別 n GSH-PX/(U/m L)SOD/(U/m L)MDA/(nmo l/L)模型組 7 172.85±24.36﹡ 89.47±12.75﹡ 11.43±1.25﹡α-ZA L治療組 7 261.39±9.37# 128.98±13.28# 6.50±0.73#正常對照組 7 279.81±8.99 134.17±15.70 5.35±0.47

2.3 小鼠腦組織中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的測定 與正常對照組比較,模型組腦組織中SOD、GSH-PX活性活性下降、MDA含量增高(P＜0.01)。與模型組比較,α-ZAL治療組 SOD、GSHPX活性活性增高、MDA含量降低,有顯著性差異(P＜0.01)(表4)。

表4 3組小鼠腦組織中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

表4 3組小鼠腦組織中SOD、GSH-PX活性和 M DA 含量比較(±s,s)

注：與正常對照組比較﹡P＜0.01;與模型組比較﹟P＜0.01

組別 n GSH-PX/(U/m L)SOD/(U/mL)M DA/(nmol/L)模型組 7 10.72±0.66﹡ 72.05±10.03﹡ 18.05±1.52﹡α-ZA L治療組 7 18.99±3.40# 100.92±13.90#10.45±1.48#正常對照組 7 20.60±0.62 107.49±15.45 8.89±1.51

3 討 論

阿爾茨海默病是老年期以漸進性記憶力和智能減退為特征的中樞神經系統退行性疾病,1906年由德國精神病學家A lois A lzheimer首次報道[5]。其臨床特點為記憶障礙、認知障礙和精神異常等癥狀,病情呈進行性加重,逐漸喪失獨立生活能力,最終多因并發感染而死亡。近一個世紀人們對AD進行了大量的研究,但由于AD的發病機制十分復雜,因此迄今為止,對于AD的有效的防治措施還遠遠沒有解決。AD顯著病理學特征為大腦皮質和海馬神經細胞外出現β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ沉積形成老年斑(senile p laques,SP)、腦神經細胞內tau蛋白異常磷酸化聚集形成神經元纖維結(neurofibrillary tangles,NFTs)和選擇性神經元缺失和突觸改變。國內外大量實驗研究表明,自由基引起氧化損傷是不同病因誘發神經退行性改變的最終的共同通路,氧化應激參與了AD的病理過程[6]。活性氧(ROS)是體內重要的自由基,它來源于線粒體磷酸化時分子氧到水的減少過程中,雙分子氧減少的結果產生超氧陰離子(O?2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(?OH),大量的自由基未能被清除,則損傷生物大分子包括蛋白質、DNA和脂質過氧化,致使神經細胞凋亡進而導致或加重AD[7]。神經細胞的減少和缺失是導致學習和記憶障礙的主要因素,MDA是自由基攻擊機體產生的終產物之一,因此測定MDA的含量常常可以反映機體脂質過氧化的程度。GSH-PX和SOD是機體內清除自由基的關鍵酶,它們可以保護機體不受自由基的損傷,對它們的監測可以反映出機體抗氧化能力的強弱。本實驗使用的轉APP基因構建AD小鼠模型已得到公認,同時為了消除內源性雌激素對本實驗的影響從而選擇了9月齡小鼠并按性別進行配對分組。結果顯示：與正常對照組比較,轉APP基因模型組空間學習記憶能力顯著下降,血清和腦組織中的GSPPX和SOD的活力降低,MDA的含量升高(P＜0.01),說明氧化應激參與了AD的病理過程。

α-ZAL是玉米赤霉烯酮的還原產物。1962年Stob等首先報道玉米赤霉醇的培養基中分離出這用物質,證明具有雌激素樣效應,可刺激小白鼠子宮增重,并可促進肉用牛羊增重而無可覺察的副作用。目前作為一種新型的植物雌激素藥物,α-ZA L已經受到人們的廣泛關注。在心血管疾病實驗研究中證實α-ZAL可以增強超氧化物歧化酶(SOD)活性,加速H2O2和超氧陰離子的清除,減輕氧化應激損傷[8]。本實驗早期給予轉APP基因AD模型小鼠α-ZAL,其結果顯示：α-ZAL對 AD模型小鼠空間學習和記憶能力有一定的保護作用,能增強GSH-PX和SOD活性,同時能有效清除體內脂質過氧化的代謝物MDA,降低腦組織NO含量,提高了機體的抗氧化能力。由此可以推斷α-ZAL可以用來早期干預或預防AD,改善患者的認知、記憶等臨床癥狀。其機制可能在于α-ZAL增強機體的抗氧化能力,保護了神經細胞,減少神經細胞的凋亡。

AD的發生是一個長時間持續性進展的過程,因此實驗必需要有較長時間的觀察才有可能獲得更準確的結論。本實驗為防治AD臨床藥物開發提供了有價值的參考依據,但是要獲得更全面的信息還需要進行大量實驗研究。相信隨著研究的深入,α-ZAL作為一種新型的植物雌激素憑借其自身優勢在防治AD等方面的應用會得到良好的發展。

1 戴順齡,段金虹,陸 媛,等.α玉米赤霉醇——一個值得重視的新的植物雌激素.中國動脈硬化雜志,2005,13(5)：670-672.

2 孫海燕,劉 舒,呂樹錚,等.植物雌激素對心血管保護作用的研究進展.臨床薈萃,2005,20(7)：414-416.

3 Dai S.Phy toestrogen alpha-zearalanol inhibits atherogenesis and im proves lipid profile in ovariectom ized cholesterol-fed rabbits.Endocrine,2004,25(2)：121-129.

4 李少春,程 煒,段 斐,等.α-玉米赤霉醇對去卵巢大鼠骨生物力學的影響.醫學研究與教育,2010,27(3)：6-8.

5 Ni Y.Activation of beta2-adrenergic receptor stimu latesgammasecretase activity and accelerates amy loid plaque formation.Nat Med,2006,12(12)：1390-1396.

6 Ch risten Y.Oxidative stress and A lzheimer disease.Am JClin Nutr,2000,71(2)：621-629.

7 于如同,李 祥,高立達,等.氧化應激誘導神經細胞凋亡與 c-M yc、Fas-FasL、核因子-κB關系的研究.中華創傷雜志,2003,19(6)：344-347.

8 王 雯,邱笑違,蔣東橋,等.植物雌激素α-玉米赤霉醇對 HUVEC低氧/復氧損傷的保護作用.中國病理生理雜志,2006,22(11)：2110-2112.