腦衰反應調節蛋白-2(CRMP-2)促進海馬神經元軸突生長

鄭紅云 李 艷 童永清

促進軸突生成不僅可以阻止AD患者腦中神經元軸突退行性變,而且還有可能促進退變軸突的再生。神經元極性是指絕大多數神經元存在一個長的軸突和幾個短的樹突。胎鼠海馬神經元培養是研究神經元極性的良好模型[1,2]。培養的海馬神經元的突起中一個突起發展成為長的軸突,剩下的突起則形成短的樹突[3]。神經元發生發展到最后成熟需要經歷6個階段[4]：神經元自圓形細胞球開始,胞體周圍開始伸出偽足(培養4 h),之后偽足逐漸形成小的突起(培養12～24 h),神經元突起繼續生長,眾多突起中有一個突起迅速生長成為軸突時,我們稱該神經元極性已經形成(培養24～48 h)。因此,神經元極性形成的標志就是其軸突的生成。雖然軸突的運輸模式及其正常的生理功能已經被研究得較為清楚,但有關神經元軸突生成的相關機制還知之甚少。

調節微管的腦衰反應調節蛋白2(CRMP-2)廣泛高表達于發育神經系統,是CRMP家族5種亞型之一[5]。海馬神經元處于生長狀態的軸突含有豐富的CRMP-2,其在軸突生長錐中主要以非磷酸化CRMP-2活性形式存在[5]。國外研究發現,CRMP-2與管蛋白異二聚體相互作用而促進微管的聚集[6];CRMP-2通過與Numb以及重組肌絲的相互作用調節某些特異的黏附分子如 L1的內吞[7];CRMP-2可以與驅動蛋白-1輕鏈作用而將管蛋白異二聚體或Sra-1連接至驅動蛋白-1(Kinesin-1),然后CRMP-2/Kinesin-1復合物可以將管蛋白等運輸到軸突遠端[8],但國內有關CRMP-2與軸突生長的關系尚無相關研究。

本實驗以原代海馬神經元培養為研究模型,通過轉染野生型或失活型CRMP-2質粒處理極性形成早期的神經元,探討CRMP-2對海馬神經元軸突生長的影響,為神經元極性形成機制提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 孕18 d的SD大白鼠30只(由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供)。

1.2 試劑及抗體 DMSO購于sigm a公司。羊抗EGFP、鼠抗 DsRed均購自 Abcam(Cambridge,MA)、Tau-1抗體購自M illipore(Temecula,CA);Amaxa大鼠神經元核電轉試劑盒(Rat Neuron Nucleofector Kit)購自 Lonza(Cologne,Germany);Rhodamine Red-X-,Oregon Green 488購自M olecular Probes(Eugene,OR,USA)。

1.3 質粒來源 The wild-type CRMP2(EGFP-w tCRM P2)and EGFP-T514D CRM P2突變體由美國Dr.K.Kaibuchi饋贈。

1.4 原代海馬神經元細胞培養 無菌條件下取出孕18 d胎鼠的完整腦組織,剔除腦膜和血管,鈍性分離出雙側海馬;將海馬剪成1mm3的組織塊(以上均在冰上進行),置入解剖液(含3-6%葡萄糖DHanks)中,0.125%胰蛋白酶(Gibco,USA)37℃消化15min,加入種植培養液(含10%胎牛血清的DMEM培養基)終止反應,滴管吹打后經200目篩網濾過,1500r/min離心5m in,加入適當的種植培養液重懸,細胞計數,調至1×107/L,接種于預鋪多聚賴氨酸的培養板或培養瓶中,于37℃、5%CO2培養箱中培養;4h后換成維持培養基(1%Glutamate/2%B27/97%Neurobasalmedia)。

1.5 免疫熒光雙標標記 處理細胞吸出培養基,PBS漂洗后加入4%多聚甲醛常溫固定15～20 min;PBS-0.1%Triton漂洗,然后PBS-0.5%Triton破膜5～10min,PBS-0.1%Triton漂洗,5%BSA封閉1 h,分別滴加羊抗 EGFP(1∶200)、兔抗DsRed(1∶1000)和鼠抗Tau-1(1∶200),于4℃孵育過夜,漂洗后分別加入熒光標記抗于室溫孵育1 h,漂洗后50%甘油封片,于雙光子共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 核電轉技術 原代海馬神經元轉染率較低,為了得到比較高的轉染效率,我們選用了Amaxa Biosysterms公司 NucleofectorⅡ電轉儀以及 Rat Neuron Nucleofector Kit對剛分離的海馬神經元進行核轉染。

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件,全部數據采用平均數±標準差(±s)表示;采用Image-Prop lus軟件統計突起長度。

2 結 果

2.1 CRM P-2促進極性建立期原代海馬神經元軸突的生長

原代海馬神經元培養24h后采用核電轉實驗分別轉染 EGFP,w tCRM P2[9]和失活型 T514DCRMP2(突變體,模擬磷酸化失活型CRMP-2)[9];第3 d檢測CRMP-2對神經元軸突生長的影響;培養72 h固定做熒光三標,分別標記EGFP和軸突標志物Tau-1。轉染EGFP載體對照組神經元正常發育,培養至48 h,神經元軸突特異性表達標志物蛋白Tau-1(圖1A,右側為局部放大圖)。過表達了野生型CRMP-2的神經元除了生成一條長的特異性表達Tau-1的軸突(圖1B,局部放大1)外,另外一條突起也發育成了特異性表達Tau-1的軸突(圖1B,局部放大2);而過表達了失活型CRMP-2的神經元發育與正常組相比無差異(圖1C),過表達了w t-CRMP-2的神經元平均軸突長度、軸突數目及多軸突神經元所占比例均明顯增加,而失活型CRMP-2影響不大(圖1D～1F)。

2.2 各組平均軸突長度、軸突數目和軸突所占比例

對照組平均軸突長度為185.4μm、軸突數目為1.1、軸突所占比例為10%;過表達野生型CRMP-2神經元平均軸突長度為250.3μm、軸突數目為2.1、軸突所占比例為40%;而轉染突變體CRMP-2的神經元神經元平均軸突長度為180.0μm、軸突數目為0.9、軸突所占比例為9%(表1)。

圖1 CRM P-2對神經元軸突生長的影響

表1 分別轉染w tCRMP-2和突變體CRM P-2對神經元軸突長度和數目的影響

3 討 論

軸突生成是神經元發生發展的必要過程,在許多神經退行性疾病包括AD中,神經元軸突營養不良可能會導致軸突退行性變和神經元大量丟失,最后表現為認知和記憶障礙[10]。因此促進軸突生成不僅可以阻止AD病人腦中神經元軸突退行性變,而且還有可能促進退變軸突的再生。

細胞內神經元突起或軸突生長需要兩種細胞骨架重組即肌絲[2]和微管[11]。微管的聚集存在于神經元的胞體和生長錐[12]。微管在軸突聚集通過2種方式：一種是微管聚合物的運輸;另一種是微管聚集加尾。這兩種方式都可以促進軸突的生長[13]。其中微管相關蛋白,如 Tau、MAP1A、MAP1B等蛋白分子在參與神經元軸突微管聚集和組裝過程中起重要作用[14]。但更多與軸突相關的微管相關蛋白在神經元軸突生長中的作用尚不清楚。

CRMPs家族在中樞神經系統的發育過程中高度表達,尤其是腦組織發育的早期表達較多,該家族包括CRMP 1-5共5個成員,它們作為突起生長的信號分子參與神經元的發育過程。國外研究發現：CRM P-2與管蛋白異二聚體相互作用而促進微管的聚集[6];CRMP-2通過與Numb以及重組肌絲的相互作用調節某些特異的黏附分子如L1的內吞[7];CRMP-2可以與驅動蛋白-1輕鏈作用而將管蛋白異二聚體或Sra-1連接至驅動蛋白-1(Kinesin-1),然后CRMP-2/Kinesin-1復合物可以將管蛋白等運輸到軸突遠端[8],但國內有關CRMP-2與軸突生長的關系尚無相關研究。我們通過轉染外源性DNA上調或下調CRM P-2表達水平,檢測了其對神經元軸突生長的影響。研究結果表明過表達野生型CRMP-2可明顯促進軸突生長,而磷酸化CRMP-2的突變體則沒有顯示任何的促進作用。以上結果表明非磷酸CRMP-2可促進神經元軸突生成和神經元極性建立。

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