血管內皮生長因子受體表達水平與胃癌臨床病理學特征的關系

楊 靜 ，景在平

1.上海市第七人民醫院外科，上海 200137；2.上海第二軍醫大學附屬長征醫院，上海 200003

胃癌在導致死亡的惡性腫瘤中目前位居第二位[1]，在我國其發病率居常見惡性腫瘤的第四位[2]。眾所周知，中晚期胃癌患者預后較差，所以如何提高胃癌的早期診斷率并尋找出新的治療靶點，是當前胃癌研究的重要課題之一。

胃癌的發生與發展是多個步驟、不同階段和復雜基因的一個改變過程。其中腫瘤血管是腫瘤生長、轉移的重要環節之一。因為腫瘤的生長和轉移依賴于腫瘤血管的生成，任何實體瘤生長超過2 mm3都必須有新生腫瘤血管支持[3]。到目前為止，血管內皮生長因子（Vascular Epidermal Growth Factor，VEGF）是已知的最強有力的血管生成因子，既能促進內皮細胞的增殖、促進血管滲漏，還可特異性誘導淋巴管的形成，在腫瘤的生長和轉移中起著至關重要的作用。然而VEGF的作用需要其與受體（Vascular Epidermal Growth Factor Receptor，VEGFR）結合才能發揮生物學效應。其受體在腫瘤細胞的病理生理機制中起著重要的作用[4]。目前已知的VEGF受體主要有以下 3種：VEGFR1（fms-liketyrosinekinase1，Flt-1），VEGFR2含有激酶插入區的受體KDR（在鼠中的同源序列被稱為 Flk-1，fetal liverkinase 1），VEGFR3 （F1t-4 和低分子量VEGFR）。那么VEGFR在胃癌分期和轉移中起著什么樣的作用呢？目前國內外關于這三種受體與胃癌的分期和轉移的關系報道較少，而且研究結果也不盡一致。本研究采用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）技術，檢測胃癌組織的VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 的表達，進一步探討 VEGFR 與胃癌臨床病理學特征關系，為胃癌的早期識別及新治療靶點的研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2008年9月～2010年9月在上海市第七人民醫院普外科住院，臨床病理資料完整的胃癌根治術后切除標本共53例。其中男38例，女15例，年齡50～75歲，病例無近期手術、創傷及其他惡性腫瘤等病史，無妊娠及嚴重心、肺、腦、腎、肝、血液系統等重大疾病。所有胃癌患者術前均未經過任何放療、化療及生物治療。

根椐國際抗癌聯盟 (UICC)制定的國際TNM分期法（2002年UICC第6版）標準進行臨床分期，具體如下：

T：原發腫瘤。TX：原發腫瘤無法評估(包括資料不全、沒有記錄等)；T0：無原發腫瘤的證據;Tis：原位癌，上皮內癌未浸潤固有膜；T1：腫瘤浸潤至固有膜或粘膜下層；T2：腫瘤浸潤至肌層或漿膜下層；T2a：腫瘤侵及肌層；T2b：腫瘤侵及漿膜下層；T3：腫瘤穿透漿膜層，未侵及鄰近結構，當腫瘤可能已經穿透肌層，并有胃結腸韌帶、肝胃韌帶或大小網膜侵犯，但沒有穿透這些組織的臟層腹膜時，仍分在T2中，如腫瘤穿透這些臟器覆蓋的臟層腹膜，則為T3；T4：腫瘤直接侵及鄰近結構。胃的鄰近結構包括：脾、橫結腸、肝、膈肌、胰腺、腹壁、腎上腺、腎、小腸和后腹膜。腫瘤由胃壁延伸到十二指腸或食管，由包括胃在內的浸潤最嚴重處的深度決定T。

N：局部區域淋巴結。NX：區域淋巴結無法評估；N0：無區域淋巴結轉移；不論切除及檢查的淋巴結總數，若所有的淋巴結都沒有轉移，定位pN0；N1：有1～6個區域淋巴結轉移；N2：有7～15個區域淋巴結轉移；N3：大于15個區域淋巴結轉移。

M：遠處轉移。MX：無法評估遠處轉移；M0：未發現遠處轉移；M1：有遠處轉移(包括肝十二指腸韌帶、胰腺后、腸系膜根部及腹主動脈旁的淋巴結受累)。

1.2 方法

免疫組織化學法測定腫瘤組織VEGFRs表達水平：術中切除原發灶后即刻取胃癌組織標本，以10%福爾馬林固定36～48 h，常規石蠟包埋，4 pm厚連續切片，依次經二甲苯脫蠟、100%、95%、80%、70%梯度酒精復水。抗原修復采用玻片浸入檸檬酸緩沖液加熱至99℃保持30 min，再室溫自然冷卻。3%過氧化氫浸泡5 min以去除內源性過氧化物酶活性。一抗（I型膠原，1∶40， 購自上海長島），均以 1∶100 配成工作濃度，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液 （phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2次后用生物素標記的二抗（上海長島）室溫孵育30 min，再用鏈酶素辣根過氧化物酶孵育30 min，DAB（上海長島）試劑盒顯色。蘇木精復染后封片。PBS代替一抗作為陰性對照，根據抗體說明書以大腸癌標本作為陽性對照。每張切片選取5個完整而不重疊的200倍視野，用Olympus BX51顯微鏡拍攝（日本），測定每個視野下陽性反應的平均光密度。圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算每張圖片中陽性表達部分的平均光密度 （mean optical density，mean OD）。以每例5個視野的平均光密度的平均值作為該例的測量值（圖1）。

圖1 胃癌組織中的血管內皮生長因子受體的表達（原始放大倍數×200倍）

1.3 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件處理。統計方法包括描述性分析、獨立樣本t檢驗、χ2檢驗、方差分析。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 一般情況

共入組53例術后病理檢查證實為腺癌的胃癌患者，所有病例術前均未行放療或者化療，其中男38例，女15例，年齡50～75歲，平均年齡65.3歲。按UICC（2002）TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期34例（其中ⅢA 16例，ⅢB 18例），Ⅳ期10例。根據常規HE染色病理檢查結果顯示，有淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移6例。常規HE檢查無淋巴結轉移病例中重新檢查出存在淋巴結微轉移9例，無淋巴結微轉移26例。

2.2 VEGFRs在不同胃癌組織中的表達

2.2.1 VEGFR1在胃癌組織中的表達 免疫組化結果發現VEGFR1在胃癌組織中平均光密度（OD值）為0.013。腫瘤浸潤深度（T）不同分期依次為：T1 0.009、T2 0.016、T3 0.014、T4 0.013，差異無統計學意義（P＞0.05）。局部區域淋巴結轉移（N）不同分期依次為：N0 0.014、N1 0.016、N2 0.012、N3 0.013，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2.2 VEGFR2在胃癌組織中的表達 免疫組化結果發現VEGFR2在胃癌組織中平均光密度（OD值）為0.025。腫瘤浸潤深度（T）不同分期依次為：T1 0.013、T2 0.022、T3 0.026、T4 0.026，差異存在統計學意義（P＜0.05）。局部區域淋巴結轉移（N） 不 同 分 期 依 次 為 ：N0 0.020、N1 0.023、N2 0.028、N3 0.027，差異存在統計學意義（P＜0.05）。對于VEGFR2分別在不同腫瘤浸潤深度（T）、局部區域淋巴結轉移（N）之間方差分析兩兩比較結果發現：T1與T2、T3、T4差異均有統計學意義（P＜0.05）；而 T2、T3、T4 之間兩兩比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。N1 與 N2、N3、N4 差異均有統計學意義（P＜0.05）；N2與N3、N4差異均有統計學意義（P＜0.05）；N3與 N4差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2.3 VEGFR3在胃癌組織中的表達 免疫組化結果發現VEGFR3在胃癌組織中平均光密度（OD值）為0.018。腫瘤浸潤深度（T）不同分期依次為：T1 0.004、T2，0.012、T3 0.019、T4 0.021，差異存在統計學意義（P＜0.05）。局部區域淋巴結轉移（N） 不 同 分 期 依 次 為 ：N0 0.011、N1 0.015、N2 0.021、N3 0.025，差異存在統計學意義（P＜0.05）。對于VEGFR3分別在不同腫瘤浸潤深度（T）、局部區域淋巴結轉移（N）之間方差分析兩兩比較結果發現：T1與T2、T3、T4差異均有統計學意義（P＜0.05）； T2 與 T3、T4 差異均有統計學意義（P＜0.05）；T3與T4差異有統計學意義（P＜0.05）；且OD值逐漸遞增。N1與N2、N3、N4 差異均有統計學意義 （P＜0.05）；N2 與 N3、N4 差異均有統計學意義 （P＜0.05）；N3與N4差異有統計學意義（P＜0.05）；且 OD 值逐漸遞增。見表 1。

表1 血管內皮生長因子受體在不同分期胃癌組織中平均光密度值的表達（）

表1 血管內皮生長因子受體在不同分期胃癌組織中平均光密度值的表達（）

注：T：原發腫瘤。T1：腫瘤浸潤至固有膜或粘膜下層；T2：腫瘤浸潤至肌層或漿膜下層；T3：腫瘤穿透漿膜層，未侵及鄰近結構；T4：腫瘤直接侵及鄰近結構。N：局部區域淋巴結。N0：無區域淋巴結轉移；N1：有1～6個區域淋巴結轉移；N2：有7～15個區域淋巴結轉移；N3：大于15個區域淋巴結轉移

P值P值T1 T2 T3 T4 N0 N1 N2 N3分期 VEGFR1 P值0.009±0.001 0.016±0.003 0.014±0.009 0.013±0.008 0.014±0.007 0.016±0.007 0.012±0.006 0.013±0.007＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05 VEGFR2 0.013±0.004 0.022±0.004 0.026±0.008 0.026±0.006 0.020±0.005 0.023±0.008 0.028±0.009 0.027±0.004＜0.05 VEGFR3 0.004±0.001 0.012±0.002 0.019±0.004 0.021±0.007 0.011±0.004 0.015±0.007 0.021±0.010 0.025±0.010＜0.05

3 討論

VEGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，具有酪氨酸激酶活性，它的表達不僅僅局限在血管內皮細胞上，在腫瘤細胞表面也可以檢測到VEGF受體。它與配基VEGF結合后可促進腫瘤細胞生長、誘導淋巴管的形成，在腫瘤的生長和轉移中起著極為重要的作用。本研究通過免疫組化技術對胃癌組織中的VEGF的三種受體VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3的表達進行測定，以期分析這三種受體與胃癌分期及病理的關系。

目前已經有VEGFR1在胃癌組織與正常組織之間差異表達的研究，而就其與胃癌的分期關系研究則鮮有報道。最近Mimori等[5]對810例胃癌患者骨髓和外周血采用實時相對定量PCR發現，胃癌的血行轉移需要VEGFR1的表達參與，其在胃癌組織中的高表達有利于胃癌的血行轉移；而通過本研究發現，VEGFR1在胃癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移不同之間均無相關性。本研究結果與Ding等[6]的研究結果在一定程度上吻合：研究顯示VEGFR1的激動表達更傾向于血行轉移，而與淋巴轉移關系可能不大。

VEGFR2在血管內皮細胞及部分腫瘤細胞上特異性表達，對于腫瘤發生、發展更是起著重要的調節作用。VEGFR2基因敲除的小鼠不能產生分化良好的內皮細胞和血管。已經有不少研究表明VEGFR2在VEGF的信號轉導及血管內皮生成上起主導作用。Brekken等[7]研究發現，用VEGF的單克隆抗體可以阻斷VEGF誘發的血管通透性增加和VEGF與VEGFR2的相互作用，卻不能阻斷VEGF與VEGFR1的相互作用，因此明確了VEGFR2在調節VEGF誘發的血管通透性增加和腫瘤血管生成中起主要作用。其后，Zeng等[8]也得到了同樣結論。這些研究提示VEGFR1和VEGFR2所引起的信號轉導級聯反應有所不同，VEGFR2有明顯促有絲分裂和化學趨化活性，在血管遇透性升高和血管生成過程中起主要作用。所以有些學者認為VEGFR2在腫瘤組織中的表達水平與腫瘤患者預后關系更為密切，但對于這一點目前仍然存在較大的爭議。如Deeaussin等[9]研究表明：VEGFR2的表達水平與癌組織中的血管生成水平呈正相關，與患者的生存期呈負相關。Harada等[10]認為VEGFR2可以作為結直腸癌患者的預測指標；而Delmotte等[11]進行的薈萃分析發現，VEGF可以作為預測患者的預后指標，但VEGFR2作為患者預后指標的證據不足。本研究結果顯示VEGFR2在胃癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移有關。

已有研究顯示，腫瘤新生淋巴管的生長主要是通過位于淋巴管內皮細胞上的VEGFR3調節來實現，腫瘤細胞分泌的VEGFC特異性地與其受體VEGFR3結合，從而使腫瘤周圍的淋巴管胚芽向腫瘤組織內部生長[12]。對于VEGFR3和胃癌淋巴結轉移的關系已有報道。如Choi等[13]研究顯示VEGFR3與胃癌淋巴結轉移密切相關，提示VEGFR3是胃癌淋巴結轉移的潛在分子標志。Yonemura等[14]研究也發現胃癌中VEGFR3水平與陽性淋巴管數存在顯著相關性[15]。另外，Juttner等[16]研究還發現VEGFR3不僅與胃癌的淋巴轉移有關，而且還能預測胃癌患者的預后，是預后的一個生物學標記物。之前提到的Ding等[6]研究發現VEGFC高表達與淋巴結轉移有關，而VEGFC的高表達又進一步結合和激動VEGFR3。本研究對于VEGFR3的研究結果與國內外研究基本一致，進一步證實了VEGFR3對于胃癌的演進和轉移起著重要的作用。另外本研究除了發現VEGFR3在胃癌組織中的表達與患者的浸潤深度、局部區域淋巴結轉移相關外，還發現在胃癌組織中的表達量隨著浸潤深度、局部區域淋巴結轉移數的增加而逐漸遞增。提示VEGFR3在胃癌組織中的表達量可以作為疾病嚴重程度的一個量化指標，VEGFR3可以反映不同的浸潤深度和淋巴結轉移情況。

本研究通過使用免疫組化技術對VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3在胃癌組織細胞中的表達與分期關系的研究發現：在不同腫瘤浸潤深度及淋巴轉移程度的胃癌組織中VEGFR1的表達差異無統計學意義（P＞0.05），而VEGFR2的表達差異有統計學意義（P均＜0.05），VEGFR3的表達差異也有統計學意義（P均＜0.05），并且在胃癌組織中VEGFR3的表達量隨著浸潤深度、局部區域淋巴結轉移數的增加而逐漸遞增，這提示VEGFR3在胃癌組織中的表達量可以作為疾病嚴重程度的一個量化指標，VEGFR3可以反映不同的浸潤深度和淋巴結轉移情況。

總之，通過本研究發現，在不同腫瘤浸潤深度及淋巴轉移程度的胃癌組織中，VEGFR2的表達有差異性，VEGFR3的表達亦有差異性，且VEGFR3的表達隨著浸潤深度、局部區域淋巴結轉移數的增加而遞增，提示VEGFR3在胃癌組織中的表達量可以作為疾病嚴重程度的一個量化指標，為研究胃癌的治療新靶點提供了進一步的理論依據。

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