MDM2-p53通路在肺腺癌中的表達及其調控機制

戴文鑫 雷懷定 吳智勇 鄭 茵 陳 娟 馮光球

(海南省人民醫院留醫部省醫療保健中心四區，海南 海口 570311)

p53介導的細胞信號轉導途徑與細胞內其他信號轉導通路間存在著錯綜復雜的相互關系，不能獨立的衡量p53的生物學功能〔1〕，而應將各個與之相關的基因綜合起來研究其體系，信號轉導途徑中任何一個環節的障礙都將影響其功能，導致細胞周期失控、基因不穩定、甚至腫瘤發生。雙微粒體2(murine double inute 2，MDM2)是一種進化上保守的癌基因，MDM2是目前研究比較廣泛的癌基因之一，在多種腫瘤中可以檢出，在功能上與p53基因密切相關。研究肺癌不同類型組織中MDM2蛋白增高表達率腺癌最高。2003年3月至2005年10月，本研究針對肺腺癌患者，通過癌組織中MDM2、p53表達的檢測，進行MDM2-p53通路的表達及其意義的探討。

1 資料與方法

1.1 標本 41例肺腺癌標本均取自湖北十堰太和醫院呼吸內科2003～2005年支氣管鏡下活檢組織。41例病例中，男24例，女17例，年齡23～71歲，均為首次確診病例，確診前未行化療、放療和其他生物免疫治療;TNM分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期12例，Ⅳ期13例。所有標本均經10%甲醛溶液浸泡固定，常規石蠟包埋保存。

1.2 試劑 一抗分別為1∶100稀釋的鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人MDM2單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體(均為Santa Cruz Biotechnology，Inc產品)。用PBS代替一抗做陰性對照;10%封閉用正常山羊血清、生物素化二抗工作液、抗辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵蛋白素及DAB顯色試劑盒均購自Dako公司。原位細胞凋亡檢測試劑盒(POD)為美國羅氏公司原裝試劑盒，購自天津津脈基因測繪技術有限公司。

1.3 方法 按免疫組化SP法進行。已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。細胞凋亡檢測采用TUNEL法。

1.4 結果判定 PCNA的陽性著色部位在胞核，PCNA染色以細胞核出現棕黃染色顆粒為陽性細胞。光鏡下取10個細胞密集的高倍鏡視野(400×)，計數1 000個腫瘤細胞中陽性細胞的百分率即增殖指數(LI)。凋亡細胞表現為細胞核中有棕黃色顆粒，同時伴有細胞縮小變圓、核致密、新月體和凋亡小體出現等改變。光鏡下隨機觀察10個高倍鏡，計數1 000～2 000個腫瘤細胞，計算凋亡細胞占全部腫瘤細胞的比例即為凋亡標記指數(ALI)，以百分率表達。

1.5 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行處理。計量資料計數用表示，計量資料比較用χ2檢驗。相關性分析采用直線相關回歸。

2 結果

2.1 MDM2在肺腺癌不同臨床分期中的表達 MDM2在肺腺癌表達陽性率為31.71%(13/41)。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺腺癌陽性表達率分別為 46.15%、30.00%、28.57%、25.00%，各組間比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 p53在肺癌不同臨床分期的表達 p53在肺腺癌中表達陽性率為53.65%(22/41)。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺腺癌陽性表達率分別為20.00%、45.45%、54.55%、71.42%，各組間比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 p53和MDM2的關系 在對41例患者MDM2和p53的染色結果對比后發現，兩種染色均為陽性者7例，均為陰性者13例。結果見表1。進一步研究將p53染色陽性的切片分成高表達組和低表達組進行分析，結果發現p53高表達組肺腺癌細胞的MDM2為9.58% ±2.16%，低表達組肺腺癌細胞的MDM2為22.81% ±5.78%，兩組差異顯著(P＜0.05)。p53和MDM2的表達之間存在相關性(P＜0.05)。

表1 各標本p53基因表達與MDM2基因表達例數(n)

2.4 p53、MDM2表達與腫瘤原發灶大小之間的關系 原發灶≥3.0 cm者，p53表達為33.43% ±7.28%，＜3.0 cm者p53為6.61% ±1.34%，二者間統計學有顯著差異(P＜0.01)。原發灶≥3.0 cm者，MDM2為 3.77% ±1.13%，＜3.0 cm者MDM2為24.53% ±4.13%，二者差異顯著(P＜0.05)。

2.5 p53、MDM2表達量高低與肺腺癌細胞增殖、凋亡之間的關系 p53高表達組肺腺癌細胞的PCNA LI為33.13%±4.65%，低表達組肺腺癌細胞的PCNA LI為16.48% ±5.21%，兩組存在統計學差異(P＜0.05);p53高表達組肺腺癌細胞的ALI為 1.34% ±0.12%，低表達組肺腺癌細胞的 ALI為1.36% ±0.09%，兩組比較無統計學差異(P＞0.05)。MDM2高表達組肺腺癌細胞的PCNALI為23.32% ±0.54%，低表達組肺腺癌細胞的PCNALI為22.99% ±0.07%，兩組比較無統計學差異(P＞0.05);MDM2高表達組肺腺癌細胞的ALI為1.27%±0.08%，低表達組肺腺癌細胞的 ALI為1.31% ±0.15%，兩組比較無統計學差異(P＞0.05)。

3 討論

肺癌的發生是一個多基因參與的多步驟的復雜過程，從腫瘤細胞學來看，肺癌發生的本質在于細胞增殖與凋亡的調節失控，抑癌基因功能的喪失和癌基因的表達是腫瘤發生的主要原因。抑癌基因p53由于含有一段序列專一性轉錄結合序列，作為轉錄因子，可調節大量靶基因的表達，在調節細胞生長、分化、衰老、應激等生命過程中起著重要的調控作用，在正常細胞中表達量極低，但是當細胞受到強有力的刺激后表達量急劇增加并被激活，從而影響細胞周期阻滯、凋亡、分化、靜息、損傷、及其他功能〔2，3〕。

p53介導的細胞信號轉導途徑與細胞內其他信號轉導通路間存在著錯綜復雜的相互關系，因此Vogelstein等〔1〕認為，不能獨立的衡量p53的生物學功能，而應將各個與之相關的基因綜合起來研究其體系，這些體系構成的網絡就是p53的生物學功能網絡。信號轉導途徑中任何一個環節的障礙都將影響其功能，導致細胞周期失控、基因不穩定、甚至腫瘤發生。MDM2是一種進化上保守的癌基因，位于染色體12 q13214，全長2.372 kb，編碼491個氨基酸組成的蛋白，人和鼠的各種組織中有廣泛表達，參與細胞的基本生理過程。MDM2的擴增與腫瘤生長、轉移有密切關系。細胞內野生型p53蛋白濃度取決于其降解的速度而不是其生成的速度。其中調節p53表達和功能的負反饋環路是p53-MDM2通路。MDM2是 p53轉錄靶基因，p53誘導MDM2的表達，MDM2蛋白與p53結合后覆蓋其N端酸性活化區，形成MDM2-p53復合物，阻斷p53轉錄活性，使p53泛素化，可作為p53的E3泛素連接體;MDM2也對p53的轉錄活性有直接抑制作用，MDM2高水平的基因產物可使p53失活，促進p53降解，尤其對野生型p53結合力強，導致基因的不穩定和細胞增生，表現出癌基因蛋白的作用，參與腫瘤形成〔4，5〕。p53在細胞內低濃度又可減少 MDM2 基因轉錄，將p53-MDM2負反饋環路關閉，使p53回到維持正常功能狀態的水平。在應激情況下，對p53-MDM2的翻譯后調節、亞細胞再分布、抑制MDM2活性、直接抑制MDM2轉錄，使得p53快速積聚，防止細胞異常生長和惡性轉化〔6〕。MDM2是細胞內調節p53濃度及活性的重要蛋白質，兩者構成似電流環路中的負反饋，彼此相互進行精細的調節〔7〕。有研究顯示p53誘導MDM2基因轉錄，MDM2蛋白和p53結合促其失活及降解;突變型p53檢出率升高，MDM2檢出率下降〔8〕，表明p53/MDM2存在負反饋機制;也有研究表明，兩者的變化具有同向性，可能與突變型p53對 MDM2的穩定性強，繼續刺激 MDM2產生有關〔9，10〕。我們的研究結果表明，MDM2、p53在肺腺癌各臨床分期的表達均有統計學差異，二者的表達之間呈負相關，支持p53/MDM2存在負反饋調節。p53與MDM2之間存在著錯綜復雜的相互作用與負反饋機制，使得p53的網絡體系更加協調和精確。我們的研究表明p53和MDM2的表達和腺癌的臨床分期、原發灶大小相關。p53和腫瘤的增殖活性有關而MDM2與之無關，二者均與凋亡指數無關，說明MDM2沒有參與腫瘤的高增殖，而p53在肺腺癌的高增殖中起著重要作用。另外還發現二者并非均為正協調作用，又存在著負協調作用，如大腺癌中p53的表達低而MDM2的表達高，這說明二者各自還存在獨立作用機制，正是p53和MDM2相互作用的復雜性導致了肺腺癌在不同發展階段的復雜表現。

我們的研究表明如果能抑制p53或/和MDM2的表達，就可以阻斷MDM2-p53通路，從而抑制肺癌的發生和發展。對肺癌進行MDM2、p53檢測分析將有利于進一步探討肺癌發生的作用機制，為肺癌的預防、診斷、治療提供理論依據。

1 Vogelstein B，Lane D，Levine AJ.Surfing the P53 net work〔J〕.Nature，2000;408:307-10.

2 Kato S，Han SY，Liu W，et al.Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by highresolution missense mutation analysis〔J〕.PNAS，2003;100:8424-9.

3 Achison M，Hupp TR.Hypoxia attenuates the p53 response to cellular damage〔J〕.Oncogene，2003;22:3431-40.

4 Buschmann T，Fuchs SY，Lee Cg，et al.SUMO-1 modification of MDM2 prevents its self-ubiquitination and increases Mdm2 ability to ubiquitinate p53〔J〕.Cell，2000;101:753-62.

5 Chne P.Inhibiting the p53-mdm2 interaction:an important target for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Cancer，2003;3(2):102-9.

6 Ryan KM，Phillips AC，Vousden KH.Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2001;13(3):332-7.

7 Lahav G，Rosenfeld N，Sigal A，et al.Dynamics of the p53-MDM2 feedback loop in individual cells〔J〕.Nat Genet，2004;36(2):147-50.

8 Martha L，Simmon S，Kathleen R，et al.Analysis of complex relationships between age，p53，epidermal growth factor receptor，and survival in glioblastoma patients〔J〕.Cancer Res，2001;61:1122-8.

9 孫艷花，鐘雪云，陳運賢，等.星形細胞瘤中MDM2、p53的表達及調控機制探討〔J〕.腫瘤防治研究，2004;31(8):477-9.

10 LeBron C，Chen L，Gilkes DM，et al.Regulation of MDMX nuclear import and degradation by Chk2 and 14-3-3〔J〕.EMBO J，2006;2225(6):1196-206.