蟾蜍靈聯合奧沙利鉑對胃癌MGC803細胞增殖抑制及凋亡的影響

朱志圖 王 鍇 郁云龍 李恩澤 劉陽陽 哈敏文 劉云鵬

(遼寧醫學院附屬第一醫院腫瘤科，遼寧 錦州 121001)

胃癌是世界發病率列為第四的惡性腫瘤，雖然早期胃癌根治性手術后的5年生存率超過90%，但是晚期患者的預后較差，5年生存率不足10%〔1〕。在我國，大約2/3的患者確診時已屬晚期，不能手術切除，放化療是治療晚期胃癌的主要手段，但化療帶來的毒副反應一直是臨床難題。蟾蜍靈是中藥蟾酥的毒性配基之一，研究發現蟾蜍靈具有抗腫瘤的作用〔2〕。奧沙利鉑廣泛用于結直腸癌，近年來發現對胃癌也具有較好療效。目前國內外關于蟾蜍靈聯合其他化療藥治療胃癌的基礎研究較少，本實驗采用蟾蜍靈聯合奧沙利鉑作用于胃癌MGC803細胞，觀察兩藥聯合對胃癌細胞體外生長抑制及誘導凋亡作用，探討其作用機制，旨在為臨床化療方案的選擇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑 胃癌MGC803細胞株由中國醫科大學腫瘤實驗室惠贈;蟾蜍靈購于Sigma公司，用無水乙醇配成0.01 mol/L貯存液，－20℃凍存，實驗時用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成所需濃度，乙醇終濃度＜0.01%，預實驗表明，該濃度乙醇對細胞增殖無影響;奧沙利鉑(50 mg/支)購于齊魯制藥有限公司;RPMI1640培養基購于Gibco公司;胎牛血清購于中國醫學科學院血液學研究所;碘化丙啶(PI)、噻唑藍(MTT)購于Sigma公司;Bax和Bcl-2單克隆抗體武漢博士德公司。

1.2 MTT法檢測蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯合用藥后細胞增殖抑制率 取處于對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，調整密度為3×104/ml，接種于96孔培養板中，每孔180 μl，實驗組加用不同濃度的單藥或聯合藥物，對照組加入RPMI 1640培養基，繼續培養24、48、72 h，終止培養前4 h每孔加入MTT液20 μl，到預定時間后加二甲基亞砜(DMSO)液200 μl，振蕩后酶聯免疫檢測儀570 nm處測定各孔吸光度值。按細胞增殖抑制率計算公式計算細胞增殖抑制率，計算藥物抑制細胞增殖50%的濃度(IC50)及聯合指數。每組實驗重復3次。細胞增殖抑制率(%)=1－(實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.3 流式細胞術分析周期阻滯及凋亡百分率 分別收集對照組及處理組細胞，1 000 r/min離心5 min，冷 PBS洗滌，加入70%的冷乙醇4℃過夜，1 000 r/min再離心5 min，后加入終濃度為10 mg/ml的PI，避光反應30 min后進行流式細胞儀測定，采用Cell Quest進行細胞各期的百分比分析，判定凋亡細胞百分率。

1.4 Western印跡法檢測蛋白的表達 將對照組和處理組的細胞加RIPA裂解液在冰上裂解30 min，12 000 r/min離心30 min，取上清，采用Lowry法進行蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。取50 μg蛋白樣品在15%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠中電泳約3 h，然后轉印至硝酸纖維素膜上2 h。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按預染Marker標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入Bax抗體(1∶300)、Bcl-2(1∶300)抗體及β-actin抗體(1∶1 000)，過夜。Tris鹽水緩沖液(TTBS)洗4次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶800)作用30 min，發光免疫分析(ECL)法顯色后GIS數碼系列凝膠圖像分析系統拍照，采用Image J軟件分析處理。

1.5 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行分析，資料數據以表示，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯合用藥對胃癌MGC803細胞的抑制作用 蟾蜍靈和奧沙利鉑單用或聯用均對MGC803生長有抑制作用，二者單用或聯用的抑制作用隨著藥物濃度和作用時間增加而增強，呈時間-劑量依賴方式，不同濃度、不同時間點之間抑制率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，聯合用藥時IC50均較單藥低，聯合指數(CI)＜1，提示兩藥有協同作用。見表1，表2;圖1。

表1 藥物對MGC803細胞增殖抑制作用(，n=3)

表1 藥物對MGC803細胞增殖抑制作用(，n=3)

與對照組比較:1)P＜0.05;與單藥組比較:2)P＜0.05

1.022±0.043 1.033±0.029 1.116±0.034蟾蜍靈組(nmol/L)10 0.721±0.0361)0.722±0.0191)0.633±0.0311)20 0.662±0.0201)0.670±0.0151)0.501±0.0271)40 0.606±0.0451)0.564±0.0261)0.452±0.0361)80 0.561±0.0251)0.440±0.0841)0.297±0.0251)160 0.452±0.0491)0.321±0.0361)0.175±0.0531)奧沙利鉑組(μg/ml)2.5 0.734±0.0381)0.652±0.0181)0.488±0.0221)5.0 0.659±0.0321)0.613±0.0291)0.367±0.0181)10.0 0.611±0.0511)0.579±0.0241)0.283±0.0321)20.0 0.521±0.0221)0.496±0.0161)0.180±0.0131)40.0 0.475±0.0271)0.381±0.0231)0.174±0.0291)聯合組10/2.5 0.646±0.0341)2)0.567±0.0641)2)0.399±0.0431)2)20/5.0 0.591±0.0821)2)0.419±0.0211)2)0.280±0.0341)2)40/10.0 0.474±0.0151)2)0.336±0.0291)2)0.198±0.0261)2)80/20.0 0.402±0.0161)2)0.228±0.0141)2)0.184±0.0201)160/40.0 0.286±0.0471)2)0.143±0.0211)2)0.125±0.0171)24 h 48 h 72 h對照組組別

表2 各組IC50及CI值

2.2 蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯合誘導MGC803細胞周期阻滯及凋亡 10 nmol/L蟾蜍靈、10 μg/ml奧沙利鉑及兩藥聯合分別作用細胞24 h后，流式細胞術檢測聯合組出現亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)，與對照組、單藥組比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，見圖1;表3。

表3 藥物作用細胞24 h周期分布(%)

2.3 蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯合對凋亡蛋白Bax、Bcl-2蛋白的影響 蟾蜍靈、奧沙利鉑單藥作用于MGC803細胞24 h后，Western印跡結果顯示Bax及Bcl-2蛋白表達無明顯變化，而聯合組Bcl-2蛋白表達下降到對照組的57.14%，Bax蛋白表達上調至對照組的145.94%，Bax/Bcl-2比值增加到對照組的2.56倍，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 流式細胞術檢測藥物誘導細胞凋亡

圖2 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討論

蟾蜍靈是傳統中藥蟾酥中蟾毒的主要成分，有強心、麻醉等作用，近年來國內外學者研究證明蟾蜍靈可以抑制白血病細胞及實體瘤細胞〔3，4〕增殖并誘導其周期阻滯和凋亡。奧沙利鉑是一種新型的鉑類抗癌藥，治療晚期或轉移性胃癌活性高且療效較好，但其神經毒性等不良反應亦困擾臨床，有報道其慢性神經毒性發生率為65% ～98%，急性神經毒性可達100%〔5〕，且缺乏有效的預防和治療方法，已證實奧沙利鉑與氟尿嘧啶、順鉑、伊立替康等有協同增效作用〔6〕，但與蟾蜍靈聯合療效尚未見報道。

本文首次采用蟾蜍靈和奧沙利鉑單藥及聯合用藥作用于胃癌MGC803細胞，結果發現兩藥單藥均可抑制細胞生長，呈時間劑量依賴效應。兩藥聯合組抑制率高于單藥組，計算24、48、72 h各組IC50得出的兩藥CI都小于1，顯示聯合用藥具有協同作用。基于MTT結果，應用小劑量蟾蜍靈及奧沙利鉑作用細胞24 h，流式細胞術顯示兩單藥未引起明顯細胞凋亡，而小劑量聯合用藥可誘導細胞凋亡，與單藥組對比有統計學差異，同樣顯示兩藥有協同作用。

抗癌藥物作用腫瘤細胞在低濃度表現為周期抑制，高濃度時表現為細胞凋亡。蟾蜍靈作用細胞周期阻滯的報道不一，Li〔7〕發現20 nmol/L蟾蜍靈可引起胃癌細胞 G2/M期阻滯，80 nmol/L時誘導細胞凋亡。奧沙利鉑是作用于DNA化學結構的細胞毒類藥物，研究發現奧沙利鉑可引起胃癌細胞G0/G1、S期阻滯〔8，9〕，提示奧沙利鉑為細胞周期非特異性化療藥物。蟾蜍靈與奧沙利鉑抗癌作用機制及對細胞阻滯周期不同，符合聯合化療原則。本實驗奧沙利鉑組S期細胞增多，且聯合組出現明顯亞二倍體凋亡峰，提示兩藥可能通過使細胞停滯于S、G2/M期，當細胞DNA合成和有絲分裂均受阻時，細胞增殖受到抑制，細胞凋亡則會增加。

Bcl-2家族被認為是細胞凋亡基因家族中重要的調控基因，自1985年Tsujim等首次發現Bcl-2基因至今已發現20種因子，根據結構和功能的不同，分為三大類，其中包括Bax亞家族，Bax通過與Bcl-2形成同二聚體或異二聚體對細胞凋亡進行調節，二者的比例決定了細胞的凋亡，當Bax增多時，形成Bax-Bax同二聚體可使線粒體膜通透性增加，細胞色素C(Cyt-C)從線粒體釋放到胞漿增多，后者通過作用于凋亡蛋白激活因子-1，繼而激活凋亡蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，從而誘導細胞凋亡〔10〕，而當Bcl-2過量時，形成Bax-Bcl-2的異二聚體，可干擾線粒體膜通道的形成，維持線粒體外膜的完整性，阻止Cyt-C與半胱天冬氨酸激活蛋白(Smac)/低等電點凋亡抑制蛋白(IAP)結合蛋白(DIABIO)(Smac/DIABLO)的釋放，從而保護細胞免于凋亡〔11〕。蟾蜍靈和奧沙利鉑促凋亡的過程均由Bcl-2家族參與〔12，13〕，本研究發現蟾蜍靈與奧沙利鉑聯合作用24 h后，Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下降，提示藥物可能通過上調Bax、下調Bcl-2發揮促進細胞凋亡的作用，與學者Wang的報道相似〔14〕。本研究為臨床聯合用藥提供一些實驗依據，但具體用藥劑量、時間及先后順序和凋亡確切機制仍需進一步研究，其藥物療效、不良反應有待臨床驗證。

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