丹參酮ⅡA抑制大鼠心室成纖維細胞增殖的機制

于 靜 孫紅霞(北華大學醫學院，吉林 吉林 3203)

心肌纖維化(MF)表現為心室成纖維細胞(CFb)過度增殖和分泌大量膠原纖維，引起間質纖維化并參與心室重塑。近年來文獻報道，一氧化氮(NO)等生物活性物質與MF的發生發展密切相關〔1〕。研究還證實氧化還原反應參與了 MF的形成〔2〕。丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSN)是常用的活血化瘀中藥丹參的提取物，具有抑制CFb增殖和間質纖維蛋白分泌作用〔3〕。本實驗在細胞水平上觀察 TSN對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導CFb增殖，以及對羥脯氨酸(Hyp)、NO水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響，探討其抑制MF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞 TSN(中國藥品生物制品檢定所生產，編號110766-200416);胰蛋白酶，寶泰克生物試劑;AngⅡ、四氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶均為Sigma公司產品;NO試劑盒為南京建成生物技術公司產品;IMDM培養基購自HyClone Utah公司;胎牛血清(FCS)，杭州四季青;Heraeus型CO2培養箱;SUNRISE TECAN FO39300型自動酶聯檢測儀(澳大利亞);EPICS-ProfileⅡ型流式細胞分析儀。日本Olympus倒置顯微鏡;超凈工作臺。出生1～3 d的Wistar大鼠心室，胰酶消化，收集細胞，置于含100 ml/L FCS的IMDM培養液中，在50 ml/L CO2、37℃、飽和濕度條件下培養60～90 min。采用差速貼壁法分離CFb，加入含100 ml/L FCS的IMDM繼續培養。經倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽性和平滑肌肌動蛋白染色陰性鑒定為所需的CFb，純度達98%，生長近融合時按1∶3傳代，實驗采用2～4代細胞。

1.2 分組 分5組，對照組:含有IMDM的培養液;AngⅡ組:培養液中加入終濃度為10－7mol/L的AngⅡ;TSN組1:培養液中同時加入10－7mol/L TSN和10－7mol/L AngⅡ;TSN組2:培養液中同時加入10－6mol/L TSN和10－7mol/L AngⅡ;TSN組3:培養液中同時加入10－5mol/L TSN和10－7mol/L AngⅡ。

1.3 MTT比色法測定CFb的增殖活力 各組細胞接種于96孔培養板，每組細胞9復孔，各處理組作用36 h。于培養結束前4 h加入5 g/L MTT 10 μl，待形成藍紫色的結晶沉淀后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl使沉淀降解，在酶聯免疫檢測儀上490 nm波長處測定光吸收值(A值)，用只加培養液不加細胞的空白孔調零。

1.4 Hyp法檢測心室中膠原含量 各處理組作用36 h，按照南京建成生物工程研究所提供的藥盒及說明測定Hyp含量，所得值/0.134即為心肌中膠原蛋白的含量。

1.5 NO活性測定 10－5mol/L TSN劑量組分別作用24、36、48、60 h。采用硝酸還原酶法測定NO，檢測細胞培養液中NO2－含量，通過顯色深淺讀取吸光度。樣品NO含量按公式〔(測定管吸光度－空白管吸光度)/(標準管吸光度－空白管吸光度)×100 μmol/L〕計算。

1.6 比色法測定CFb中SOD活性和MDA含量 各處理組作用24 h，取100 μl上清液，532 nm 處，1 cm 光徑，蒸餾水調零，按照試劑盒說明操作，測各管吸光度值。

1.7 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件，結果數據以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 觀察CFb生長形態變化 各處理組作用36 h后，放置在倒置顯微鏡下觀察CFb形態變化。對照組胞質豐富，細胞呈梭型且連接豐富;AngⅡ組CFb增生呈火焰狀，細胞生長密集;TSN組細胞密度明顯降低，間隙逐漸增大。見圖1。

2.2 MTT法檢測CFb的增殖活力 AngⅡ能夠明顯提高CFb對MTT的代謝率，MTT值明顯升高，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，說明AngⅡ對CFb有促增殖作用。加入不同劑量的TSN后，MTT值明顯低于AngⅡ組，有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，且此抑制作用具有劑量依賴性。見表1。

2.3 Hyp法測定CFb膠原含量 AngⅡ組膠原含量升高，與對照組相比差異顯著(P＜0.05);TSN作用后，呈明顯的量效依賴性膠原含量下降，與AngⅡ組相比有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

2.4 CFb培養液中NO系統活性測定 AngⅡ組NO水平明顯減少，與對照組比較差異顯著(P＜0.05，P＜0.01);TSN可呈時間依賴性升高CFb中NO含量，與AngⅡ組相比差異顯著(P＜0.05)或非常顯著(P＜0.01);TSN 60 h組與TSN 24 h組相比差異非常顯著(P＜0.01)。見圖2。

2.5 CFb中SOD活性和MDA含量 與對照組相比，AngⅡ組SOD值明顯減少(P＜0.05)，MDA顯著升高(P＜0.01)，TSN各劑量組可不同程度地升高SOD活性，降低MDA含量，與AngⅡ組相比差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表1 各組細胞增殖活力(OD值)及膠原含量(，n=8)

表1 各組細胞增殖活力(OD值)及膠原含量(，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 OD值 膠原(μg/mg)0.298 9±0.042 3 1.74±0.34 AngⅡ組 0.360 0±0.024 31) 2.91±0.271)AngⅡ +TSN 10－7組 0.268 2±0.032 82) 1.40±0.432)AngⅡ +TSN 10－6組 0.220 7±0.035 72) 1.26±0.422)AngⅡ +TSN 10－5組 0.180 8±0.062 53) 1.08±0.373)對照組

表2 各組SOD活性及MDA含量比較(，n=6)

表2 各組SOD活性及MDA含量比較(，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與AngⅡ組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)19.17±3.32 2.06±0.71 AngⅡ組 13.60±2.271) 7.06±1.642)AngⅡ +TSN 10－7組 15.61±2.143) 5.97±1.283)AngⅡ +TSN 10－6組 16.50±3.733) 5.88±1.093)AngⅡ +TSN 10－5組 17.17±2.664) 4.71±1.124)對照組

圖1 各組CFb生長形態變化(×200)

圖2 各組細胞作用不同時間NO含量比較

3 討論

高血壓、心肌梗死、糖尿病等多種疾病可引起CFb增殖并轉化為肌成纖維細胞，使細胞外基質(ECM)大量合成與分泌，沉積于心臟間質部位，產生MF，導致心功能嚴重受損〔4〕。因此調控成纖維細胞增殖及分化可能是防治MF、改善心臟病預后的關鍵措施之一〔5〕。本實驗結果顯示，給予TSN后，可使AngⅡ作用下的CFb MTT-OD值顯著降低，膠原蛋白含量下降。

在調節MF的生物活性因子中，NO受到重視。心肌局部內皮素、NO等生物活性因子是心肌間質CFb增生和MF的重要中介因子〔6〕。心血管系統中，NO除可抑制心肌細胞凋亡〔7〕，還與心室肥厚的發生、發展有著密切的關系〔8〕。在體研究證實，NO生成不足可加速由AngⅡ持續輸注引起的纖維化，并使其加重〔9〕。近年來研究顯示，內源性的NO可通過自分泌和(或)旁分泌的途徑抑制CFb增殖和膠原合成，降低細胞外膠原沉積，其生成增加可拮抗AngⅡ所致的MF，延緩并逆轉心室肥厚，改善心肌纖維化〔10〕。TSNⅡA是丹參的重要心血管活性成分，具有改善微循環、抗缺氧、抗缺血作用〔11〕，但TSN作用下的CFb NO活性變化及其與MF的關系報道不多。有資料顯示，正常大鼠的CFb能夠分泌一定量的NO〔12〕。本實驗結果表明:AngⅡ組NO水平明顯下降，用藥后TSN各劑量組NO水平升高，與AngⅡ組相比差異顯著，且NO水平隨TSN作用時間增加而升高，呈明顯的時間依賴性。

近幾年的研究顯示，氧化應激反應參與心室重構〔2〕，AngⅡ可作為一種內在的氧化劑，促使氧化應激的發生，在高血壓、糖尿病等疾病引起的心臟損害中發揮重要作用〔13〕。Nakagami等〔14〕用AngⅡ誘導新生鼠心肌細胞肥大，研究發現肥厚反應由介導，抗氧化劑能減輕氧化應激，所有反應可被AT1R阻斷劑所阻斷。提示AngⅡ與AT1R結合后，可激活還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶產生，同時體內SOD、GSH-Px等抗氧化系統清除氧自由基能力減弱，導致氧自由基堆積。本文結果表明，AngⅡ組SOD活性明顯降低，MDA水平明顯升高，與對照組相比差異顯著。TSN干預組能顯著提高SOD活性、降低MDA水平，說明TSN通過其抗氧化作用抑制AngⅡ誘導的氧化應激反應，從而抑制MF的發生。

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