肝細胞生長因子對結締組織生長因子刺激下腎小管上皮間質纖維化的影響

王昆 吳陽 楊昱 劉超

結締組織生長因子(CTGF)作為TGF-β的下游效應介質，在高糖血癥-轉化生長因子β(TGF-β)-CTGF-腎間質纖維化模式中起著重要的作用。而阻斷CTGF導致的腎小管間質纖維化將有效延緩糖尿病腎病的發展。

研究表明[1]，肝細胞生長因子(HGF)在糖尿病腎病發展過程中存在著潛在的治療作用。而目前，多數研究均著重于HGF阻斷TGF-β所致的腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞纖維化，但對于CTGF在阻斷上述過程中的作用并不明確。本實驗先前的研究表明HGF對CTGF的表達有抑制作用，如能證明其對CTGF所致腎小管上皮細胞纖維化過程亦有阻斷作用將進一步為HGF治療糖尿病腎病提供有效證據。

本試驗將通過觀測rhHGF對CTGF刺激下腎小管上皮間質纖維化的影響來進一步探討HGF在此過程中的具體作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養試劑HKC細胞株，重組人HGF(rhHGF，Peprotech公司，美國)和重組人CTGF(rhCTGF，Peprotech公司，美國)。

1.1.2 RT-PCR試劑Trizol(Gibco，美國)，逆轉錄試劑盒(Promega，美國)，PCR試劑盒(Promega，美國)，聚合酶鏈反應引物(英駿生物技術，中國)。

1.1.3 Western印跡法試劑分光光度儀(Pharmacia Biotech，美國)，垂直電泳儀(BioLabs，美國)，PVDF印跡膜(Millipore，美國)，ECL發光反應系統(Cell Signaling，美國)，鼠抗人α-SMA單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz，美國)。

1.2 方法

1.2.1 人腎小管上皮細胞株(HKC)培養HKC用含10%FCS的DMEM/F12培養液傳代培養，培養條件為37℃，5%CO2。0.25%胰蛋白酶消化細胞后，以1×106/瓶的密度接種于25 ml培養瓶。用10%FCS-DMEM/F12培養細胞6 h后，以無血清培養基培養12 h，使細胞同步于靜止期。

HKC孵育18 h后，吸棄培養液，分3組:①換以新鮮DMEM/F12營養液(葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)，繼續培養78 h。②換以含CTGF營養液，終濃度為5.0 ng/ml，繼續培養78 h。③換以含CTGF營養液，終濃度為5.0 ng/ml，同時加入rhHGF終濃度濃度分別為50、100和200 ng/ml，繼續培養78 h。

1.2.2 COLA41、FN、α-SMA、CTGF及TGF-β mRNA檢測RT-PCR按Trizol說明書在培養瓶提取細胞RNA，定量后取總RNA2ug作逆轉錄，步驟參照試劑盒說明書。取1 μl逆轉錄產物為模板，以50 μl反應體系進行PCR擴增。取PCR產物5ul在2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察結果并照相，用計算機圖像處理系統處理，以吸光度代表表達量，計算上述產物的相對表達量(即各基因條帶吸光度/β-actin基因條帶吸光度)。至少重復6次獨立的RT-PCR全過程。

Western印跡①SDS-PAGE:分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%的垂直電泳。樣品中加入上樣緩沖液，加熱變性，恒壓120V，電泳7～8 h。②轉膜:采用電轉移裝置，將電泳后凝膠上的血清成分轉移到硝酸纖維素膜上，恒流100 A，8 h。③蛋白印跡反應:雜交反應液置4℃，反應12 h。去離子水漂洗膜后，反貼法覆于混合液滴上孵育5 min，在暗室內膠片感光60 s，顯影1.5 min，定影2 min，清水沖凈晾干，結果用數碼成像系統掃描，測定光密度值并計算α-SMA與GAPDH光密度比值。

2 結果

2.1 rhHGF對CTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表達的影響(采用半定量RT-PCR法)。

如圖1所示:rhHGF濃度分別為25、50、100、200 ng/ml，與單純CTGF組比較，FN和α-SMA表達均明顯減少，且其表達量呈劑量依賴性(P＜0.01)。

圖1 rhCTGF刺激后α-SMA基因表達變化

表1 rhHGF對rhCTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表達的影響

2.2 rhHGF對rhCTGF刺激下HKC α-SMA蛋白表達的影響

圖2 rhHGF刺激后α-SMA蛋白表達變化

如圖2所示:rhHGF濃度分別為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml，與單純CTGF組比較，α-SMA蛋白表達量明顯減少，且其表達量呈劑量依賴性。

表2 rhHGF對rhCTGF刺激下α-SMA蛋白表達的影響

3 討論

CTGF屬于CCN(包括Cyr61/Cef10，NOV和ELM-1)家族，富含半胱氨酸，為36～38kDa的單體分泌蛋白，其編碼基因位于染色體6q23。血清生長因子、TGF-β1、骨形成蛋白、糖皮質激素、纖維蛋白酶等均可激活其表達[2]。目前，對CTGF的生理功能尚未完全清楚[3]，研究提示[4]，CTGF作為TGF-β的下游效應介質，可以介導TGF-β的負面效應，被認為糖尿病腎病發生與進展的關鍵因子。

本研究發現，加入rhHGF后，CTGF刺激下FN、α-SMA表達均明顯下調，提示HGF可抑制CTGF所致HKC纖維化;同時，不同劑量HGF對纖維化因子表達量的影響，反映了HGF抑制HKC纖維化過程是劑量依賴性的;而rhHGF可在不影響CTGF表達的情況下，抑制后者所致纖維化，表明HGF亦可能通過阻斷CTGF的致纖維化途徑而發揮作用，但具體機制仍不明確;對比本實驗第二部分結果，在高糖刺激下，rhHGF下調非CTGF所致的COL4A1表達，提示HGF抑制HKC纖維化可能還通過CTGF以外的其他途徑。有研究表明[5]，HGF可通過激活細胞外絲裂原活化蛋白激酶(p42/44 mAPK)通路，削弱TGF-β細胞內信號傳導蛋白Smad2/3核轉位，來阻斷纖維化過程。

綜上所述，本研究認為，HGF可抑制CTGF所致的腎小管間質纖維化，表明其可通過阻斷CTGF的下游途徑發揮其抗腎小管間質纖維化的作用，本研究先前實驗提示，HGF的抗腎小管間質纖維化作用還可能通過CTGF以外的其他途徑。因此，需進一步研究了解HGF阻斷DN發展的具體機制，從而充分認識HGF在DN治療中的價值。

[1]Junwei Y，Chunsun D.Hepatocyte growth factor suppresses renal interstitial myofibroblast actovation and intercepts smad signal transduction.Am J Pathol，2003，163(2):621-632.

[2]Inoue T，Okada H，Kobayashi T，et al.TGF-betal and HGF coordinately facilitate collagen turnover in subepithelial mesenchyme.Biochem Biophys Res Commun，2002，297(2):155-160.

[3]Junwei Y，Youhua L.Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis.J Am Soc Nephrol，2002，13:96-107.

[4]Herrero I，Torras J，Franquesa M，et al.HGF gene therapy attenuates renal allograft scarring by preventing the profibrotic inflammatory-induced mechanisms.Kidney Int，2006.