SIRT2對腦缺血再灌注損傷后神經保護作用及機制研究

鄭超波， 江靜雯， 殷衛海 劉建榮

很多蛋白的生物學活性可以被可逆的翻譯后的修飾來協調［1］。近年來，蛋白賴氨酸e-氨基的乙酰化在調控細胞內的一些關鍵的生物學功能作用受到廣泛關注［2，3］。目前研究證實參與去乙酰化和乙酰化調控的酶分別只有組蛋白脫乙酰基酶(HDACs)和組蛋白乙酰轉移酶(HATs)［2，4］。其中 Sirtuins 是一種以NAD為輔酶的比較特殊的去乙酰化酶，Sirtuins蛋白共有7種(SIRT1-7)，每種都有1個由275個氨基酸組成的催化核心區域，SIRT2主要表達在細胞質中，但是在細胞分裂的G2/M期可以進入細胞核中使得組蛋白H4脫乙酰基從而調控細胞分裂周期［5，6］。雖然 SIRT2是一種組蛋白脫乙酰基酶，但其底物也可以是其他的一些蛋白如P53、FOXOs和NF-κB等。在氧化應激和炎癥刺激下，SIRT2可以分別通過對Foxo3a和NF-KB脫乙酰基來減少細胞在應激下引起的損傷［7，8］，并且有研究指出在雙氧水刺激后，AGK-2可以加重PC12細胞內ATP值的下降［9］，炎癥、氧化應激和細胞內ATP值下降是腦缺血再灌注損傷的重要病理過程，因此SIRT2在腦缺血中可能存在神經保護的作用。在本次實驗中利用缺血再灌注損傷小鼠模型來觀察缺血前后皮質中SIRT2蛋白水平的變化，并探討SIRT2在腦缺血再灌注損傷中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 選擇成年健康雄性CD1小鼠86只，體重25～30g，由中國科學院上海實驗動物中心(斯萊克實驗動物有限公司)提供。實驗第1部分將小鼠隨機分為假手術對照組15只，缺血再灌注組33只，即缺血60min，再灌注6h 6只，12h 12只，24h 15只;實驗第2部分小鼠隨機分為DMSO組 6只，AGK-2(2.5mmol/L)組 6只，AGK-2(5mmol/L)組6只;第3部分小鼠隨機分為假手術組5只，DMSO組5只，AGK-2(2.5mmol/L)組5只，AGK-2(5mmol/L)組5只。

給藥途徑和方法:參考細胞中AGK-2給藥的方法［9］術前給予左側側腦室定位注射不同濃度(2.5mmol/L、5.0mmol/L)AGK-25μl，對照組給予 DMSO 5μl，側腦室坐標參考小鼠解剖圖譜定位于前囟后0.7mm，旁開 1.5mm，進針2.0mm，給藥后即給予手術。

1.2 腦缺血再灌注損傷(t-MCAO)模型的制作

1.2.1 栓線的處理 將6-0栓線(Dermalon，0.12mm，美國)的尖頭靠近高溫燒灼器(Bovie，美國)燒成圓頭，切割1.5cm，然后將栓線伸入含有硅橡膠的 PE-10(BD，I.D.0.28mm)管中，包裹長度約2.0mm，沾有硅橡膠的線拴直徑約為0.25mm，自然晾干。

1.2.2 手術過程 手術參考既往文獻介紹的方法［10］將線栓從頸外動脈處逆行插向頸總動脈的分叉處，再將線栓轉至頸內動脈腔，動作輕緩地將線栓小心經顱內段頸內動脈插入至感到輕微阻力，進線深度為0.9±0.05cm，用套線將線栓固定在頸外動脈殘端，60min后拔出線栓。手術過程保持小鼠的體溫在37±0.5℃。將線栓阻塞后血流降低至線栓阻塞前血流的20%以下，60min拔出線栓后血流上升至阻塞前血流的80%以上的小鼠為手術成功模型做后繼的實驗。動物蘇醒后表現為提尾時右側前肢內收屈曲、同側Horner征、爬行時向右劃圈;站立時右側傾倒，凡有上述4項體征者列入研究對象。假手術對照組小鼠僅進行頸部血管分離和頸外動脈結扎。

1.3 Western blot法檢測 處死小鼠后，斷頭取腦，在動物顯微鏡下分離缺血側皮質，放入1.5ml的EP管中，隨后加入RIPA，Cocktail，PMSF抽提總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，隨后進行電泳。電泳時用5%濃縮膠，10%的分離膠，電壓首先用50V，待指示條帶越過濃縮膠后將電壓調制120V，指示帶到達分離膠底部時終止電泳，隨后取膠轉膜，半干轉13V 20min，用5%的脫脂牛奶常溫封閉1h，TBST×3次每次15min，加入多克隆一抗(SIRT2:兔抗小鼠，1∶300，Santa Cruz;Actin:羊抗小鼠，1∶1000，Santa Cruz)4℃搖晃過夜，TBST×3次 每次15min，加入二抗(羊抗兔，1∶5000，Beyotime;兔抗羊，1∶5000，Beyotime)常溫下搖晃 1h，TBST ×3 次每次15min，隨后在膜表面加入化學發光底物(1∶1混合，Thermo)，1min后在化學發光檢測系統中顯影(Bio-rad)。

1.4 RNA 檢測

1.4.1 組織中RNA提取 處死小鼠后，斷頭取腦，在動物顯微鏡下分離缺血側皮質和紋狀體，分別放入1.5ml的 EP管中，加 Trizol試劑，每100mg組織對應1ml Trizol混勻，4℃離心(12000r/min×10min)，取上清液加入 200μl氯仿，混勻，4℃離心(12000r/min×15min)，取上清液加入等體積異丙醇，搖勻，室溫靜置10min，4℃離心(12000r/min×10min)，白色沉淀即為mRNA。棄上清，用1ml 75%乙醇洗 mRNA，4℃離心(7500r/min×5min)，棄上清，生物安全柜開風機晾干沉淀，每管加20ml的DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水溶解。分光光度計OD260/280測總RNA濃度，－70℃凍存。

1.4.2 逆轉錄cDNA 引物序列 SIRT2 F:5’-GCCTGGGTTCCCAAAAGGAG-3’ R:5’-GAGCGGAAGTCAGGGATACC-3’;內參 GAPDH F:5’-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3’R:5’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’。均由上海生工生物工程公司合成。以前面提取的總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物，Quant qRT-PCR(SYBR Green I)Kit進行逆轉錄反應，嚴格按說明書操作程序執行，獲得的反應產物(cDNA)置入－20℃冰箱保存，待下一步實驗使用。

1.4.3 Real-time PCR 反應 在 200μl的滅菌離心管中加入:(25ml反應體系)模板cDNA 0.5μl，上游引物 0.5μl，下游引物 0.5μl，SYBR green supermix 12.5μl，去離子水 11μl。把離心管迅速放入PCR擴增儀，按擴增程序進行PCR擴增(94℃預變性 5min;94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，40 個循環;72℃延伸7min)。

1.5 免疫熒光染色

1.5.1 冰凍切片的制備 麻醉動物后斷頭，取腦，將腦組織置于－80℃的異戊烷中冷凍，以OCT包裹腦組織后用冰凍切片機(Leica德國)切片，取材部位從距離嗅球2mm開始到見到腹側海馬為止，切片置于－80℃冰箱內保存待用。

1.5.2 SIRT2免疫熒光染色 將冰凍切片從－80℃冰箱取出，在室溫下風干30min，用4%的多聚甲醛固定10min，PBS(1×)清洗3次，每次5min，然后加入10%的BSA封閉30min，加入一抗(兔抗小鼠，1∶300，Santa Cruz)，4℃冰箱中放置過夜，PBS×3次，每次 5min，加入熒光抗體(1∶200，Alex568)，常溫孵育1h，PBS ×3 次，每次 5min，加入DAPI孵育5min，PBS×3 次，每次5min，用防猝滅劑封片液封片，在激光共聚焦顯微鏡下(Leica德國)觀察，獲取圖像(×400)。

1.6 再灌注后24h梗死體積計算 再灌注后24h，過量麻醉小鼠致死，取腦，將腦切成2mm的冠狀腦片，共5片。將腦片放入2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中，37℃，孵育20min，放入4%多聚甲醛中;梗死部位顯現白色，而鮮紅色代表未缺血的部位，缺血側的梗死面積用Image J軟件分析，梗死體積計算:第一片和最后一片的體積按照圓錐體來算則V=2/3×(S+√S)，中間部分則按梯形體來算 V=2/3×［(Sn+Sn+1+√(Sn+Sn+1)］，梗死總體積則將兩部分相加。

1.7 再灌注后24h神經功能損害評分 采用CHOPP評分標準［11］對神經功能損害進行評分。

1.8 MPO和SOD活性測定 分別按照MPO、SOD活力試劑盒(南京建成)中說明書的方法對缺血側腦組織中的MPO和SOD活性進行檢測。

2 結果

2.1 不同時間點假手術組和I/R組小鼠皮質中SIRT2 mRNA和蛋白的表達變化 皮質中，與對照組比較，SIRT2 mRNA水平在再灌注后6、12、24h表達逐漸升高(P＜0.05)，并且在24h升高最為明顯(見圖1);和mRNA的結果相符，SIRT2的蛋白水平在再灌注后12、24h表達升高(P＜0.05)(見圖2、圖3)。

2.2 假手術組和I/R 24h小鼠皮質中SIRT2免疫熒光染色結果 通過免疫熒光染色發現與假手術對照組相比，再灌注損傷24h后，可以看到皮質區的SIRT2的表達上調(見圖4，I－II);并且在再灌注24h后，皮質中的SIRT2和假手術組一樣也是表達在細胞質中(見圖4，II)。

2.3 再灌注后24h梗死體積測定和神經功能評分結果 AGK-2是一種特異性的SIRT2活性抑制劑［9］，當側腦室注射不同濃度的AGK-2后，發現AGK-2(5.0mmol/L)組和DMSO對照組比較梗死體積增大(28.99 ± 3.34mm3，16.48 ± 1.09mm3，P=0.028)，神經功能缺損加重(9.43 ±0.53，6 ±0.46，P=0.002);而 AGK-2(2.5mmol/L)和對照組相比梗死體積(15.31 ±1.21mm3，16.48 ±1.09mm3，P=0.5)和神經功能評分(6.38 ±0.42，6 ±0.46，P=0.58)均無明顯差異(見圖5、圖6)。

2.4 假手術組和再灌注后24h SOD和MPO測定的結果 分別利用SOD、MPO試劑盒來檢測缺血側/左側腦組織中SOD和MPO的活性，得出AGK-2(5.0mmol/L)組和DMSO組相比顯著增加MPO活性(2.72 ±0.50 活力單位/克濕片，0.39 ±0.03 活力單位/克濕片，P=0.019)，減少 SOD 活性(5.29 ±1.04U/mgprot，13.80 ± 1.04U/mgprot，P=0.004);AGK-2(2.5mmol/L)和 DMSO 組比較對 MPO(0.59±0.12 活力單位/克濕片，0.39 ±0.03 活力單位/克濕片，P=0.2)，SOD 活性(13.03 ±2.50U/mgprot，13.80 ± 1.04U/mgprot，P=0.30)影響不大;DMSO對照組和假手術組比較 MPO(0.39±0.03活力單位/克濕片，0.15 ±0.03 活力單位/克濕片，P=0.02)和 SOD 活性(13.80 ±1.04U/mgprot，25.01 ±1.16U/mgprot，P=0.002)均有統計學差異(見圖7)。

圖1 再灌注后不同時間點和假手術組皮質中SIRT2 mRNA表達水平比較

圖2 假手術組和再灌注后12、24h皮質中的SIRT2蛋白表達(Western blot)

圖3 再灌注后12、24h皮質中和假手術組SIRT2蛋白表達水平比較

圖4 對照組和缺血再灌注后24h皮質中SIRT2的表達

圖5 AGK-2給藥組和DMSO對照組TTC染色

圖6 AGK-2給藥組和DMSO對照組再灌注后24h梗死體積和行為學評分統計圖

圖7 假手術組、AGK-2組和DMSO組的MPO、SOD活性統計圖

3 討論

SIRT2是Sirtuin家族中的一種，表達在細胞質中，Wang等人在細胞中給予雙氧水(100μmol/L或500μmol/L)刺激24h后 SIRT2的 mRNA水平上調［7］，并且在心肌細胞中，給予缺氧再充氧后，隨著缺氧時間的增加SIRT2 mRNA的表達也是逐漸增加的［12］，在本次實驗中，缺血再灌注后 6、12、24h，皮質中的SIRT2 mRNA水平表達上調，并且與mRNA結果相符，在再灌注后12、24h皮質中的SIRT2蛋白水平表達增高。SIRT2在腦組織中的表達很豐富，在體內和體外研究中都提示SIRT2主要表達在少突膠質細胞中，也可以在一些神經元中表達［13～15］。幾乎所有的研究都證實，在有絲分裂后的細胞中，無論是少突膠質細胞還是神經元SIRT2都只是表達在細胞質中［14］;同樣在雙氧水刺激后，Wang等人也并沒有在細胞核中發現SIRT2的存在［7］，并且Karin等人研究證實在細胞給予IL-6刺激后，同樣不會引起SIRT2往核內的轉移［8］，在本次實驗中我們也發現和假手術對照組相比，腦缺血再灌注后皮質中SIRT2沒有和細胞核融合。

我們利用SIRT2特異性的活性抑制劑AGK-2，將其定位注射至側腦室中，可以發現高濃度的AGK-2(5mmol/L)可以加重缺血再灌注后的神經損害作用，提示SIRT2對于缺血后的腦組織有保護作用。炎癥和氧化應激是參與腦缺血再灌注損傷的重要的兩個因素，既往研究證實不論是抑制缺血后腦組織中的炎癥反應還是降低腦組織中的氧化應激水平都具有神經保護作用［16，17］，因此我們利用 MPO 和SOD試劑盒分別對給藥組和對照組腦組織中的炎癥和氧化應激水平進行檢測，發現高濃度的AGK-2可以加重缺血后腦組織中的炎癥水平，而降低其氧化應激水平;但是對于在缺血后腦組織中AGK-2調控炎癥和氧化應激的機制目前尚不清楚，但有研究證實在給予雙氧水刺激的細胞中，SIRT2可以促進FOXO3a的轉錄活性，刺激MnSOD的表達，增加細胞的抗氧化應激的能力，并且Karin等人研究發現在炎癥因子的刺激下，細胞中SIRT2可以使得NF-κB去乙酰化，從而減少其的轉錄活性，減少炎癥介質如 IL6、MMP9 和 COX-2 的表達［8］，以上證據提示SIRT2可能分別是通過調控 NF-κB和 FOXO3a影響腦缺血再灌注損傷后的炎癥和氧化應激水平，這還需要動物實驗去證實。

SIRT2對腦缺血再灌注損傷的神經保護還可能有其他的機制參與，有研究報道在體外實驗中，過表達SIRT2可以去乙酰化P53，使得P53的轉錄活性降低從而減少細胞的凋亡［18］，相反SIRT2的下調可以導致P53的細胞內聚集而導致細胞的凋亡［19］;在氧化應激情況下SIRT2還可以加重細胞內的ATP值的下降［9］，以上提示SIRT2可能也可以通過調控凋亡和細胞內的ATP水平對缺血再灌注損傷起到保護作用，但還需動物實驗去證實。

通過本次實驗，我們得出和假手術組相比，缺血再灌注損傷皮質中SIRT2的mRNA和蛋白的表達增高;并且SIRT2可以通過降低腦組織中炎癥和氧化應激水平來減輕缺血再灌注引起的腦組織損傷。

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