酪氨酸蛋白激酶EphA7蛋白在胃癌組織中的表達及與其預后的關系

陳千益 歐敬民 劉穎斌 穆嘉盛 莊鵬遠 何曉華

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)病機制中已發(fā)現許多相關基因高或低表達、變異或缺失等影響著腫瘤的惡性轉化、侵襲或轉移發(fā)揮著重要的作用。通過檢測胃癌組織中的相關基因，對臨床治療及評估預后有一定的價值。近年來，酪氨酸蛋白激酶EphA7在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用受到越來越多關注，已發(fā)現EphA7在許多惡性腫瘤中表達異常，且與腫瘤血管的形成、腫瘤細胞的增殖、侵襲或轉移過程有密切關系［1～6］。本研究通過檢測酪氨酸蛋白激酶 EphA7蛋白在胃癌組織中的表達，旨在探討EphA7蛋白表達水平及與其臨床病理特征和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院2003年1月至2008年12月、手術切除并經病理組織學檢查證實為胃癌的83例標本作為實驗組，術前均未行放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療。其中男性56例，女性27例;年齡43～82歲，平均64歲。83例胃癌中，近端胃癌(U)17例(20.5%)、中段胃癌(M)13例(15.7%)和遠端胃癌(L)53例(63.8%)。經病理檢查證實高分化腺癌11例(13.3%)，中分化腺癌35例(42.2%)，低分化腺癌29例(34.9%)(其中印戎細胞癌16例、黏液腺癌13例)，未分化腺癌8例(9.6%);Borrmann大體類型:潰瘍型11例(13.3%)，乳頭狀型17例(20.5%)，結節(jié)型 23 例(27.7%)，浸潤型 32 例(38.5%);浸潤深度:T1 4 例(4.8%)(黏膜下層)，T2 21例(25.3%)(肌層6例、漿膜下層15例)，T3 39例(47.0%)(漿膜層)，T4 19 例(22.9%)(累及鄰近臟器);淋巴結轉移:陰性23例(27.7%)，陽性60例(72.3%);TNM 分期:Ⅰ期 6 例(7.2%)，Ⅱ期 14 例(16.9%)，Ⅲ期 35 例(42.2%)，Ⅳ期 28 例(33.7%)。83例患者中45例行血清CA19-9、癌胚抗原(CEA)檢查，其中血清CA19-9陽性率為84.4%(38/45)(分界值34 000 U/L)，血清 CEA陽性率為22.2%(10/45)(分界值19 μg/L)。對照組30例癌旁組織，均經病理檢查證實為手術切緣陰性標本。

1.2 試劑與方法

EphA7蛋白鼠抗人單克隆抗體購于福州邁新生物技術有限公司，S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。應用免疫組化法，檢測胃癌組織中EphA7表達，將蠟塊制成4 μm厚的切片。選取1張行常規(guī)HE染色，確定組織學分化程度，檢測胃癌組織中EphA7表達的步驟如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水洗;0.01 mol/L pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓1.5 min，分別用3%H2O2和非免疫血清阻斷內源性過氧化物酶活性，并封閉非特異性結合位點;滴加一抗(EphA7 1∶200稀釋)，4℃過夜;生物素標記的二抗37℃孵育30 min;SP復合物37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染3 min，鹽酸酒精分化2～3 s，脫水、透明、中性樹膠封片。以已知EphA7陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定標準

1.3.1 雙人盲法觀片 在不知道臨床病理資料的情況下，對免疫組化切片進行評估。EphA7抗原定位于細胞質內，胞質內出現棕黃色或棕褐色的顆粒或斑片，癌旁正常組織中也可見EphA7陽性表達，但顏色較淺，呈淺黃色。

1.3.2 光鏡下計分標準 按切片中細胞顯色有無及深淺計分(A):0分，細胞無顯色;1分，胞質顯色為淺黃色;2分，胞質顯色為棕黃色;3分，胞質顯色為棕褐色。按切片中顯色細胞的比例計分(B):1分，顯色癌細胞占癌細胞總數＜1/3;2分，癌細胞顯色比例在1/3～2/3;3分，癌細胞顯色比例＞2/3。每例積分=A×B，按積分高低分為:0分為陰性(－);1～2分為弱陽性(+);3～6分為陽性(++);＞6分為強陽性(+++)。

1.4 隨訪及統(tǒng)計學方法

電話隨訪或信訪。采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件，根據數據類型不同分別進行t檢驗、Spearman秩相關分析、χ2檢驗及Fisher精確概率法;生存率的計算采用Kaplan-Meier法，并作Long-Rank檢驗及 Cox多因素生存分析。

2 結果

2.1 EphA7蛋白在胃癌組織中的表達情況

EphA7蛋白主要表達于腫瘤細胞胞質和血管內皮細胞，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀或斑片狀，染色均一;癌旁組織中也可見EphA7蛋白陽性表達，但顏色普遍較淺，呈淺黃色。83例腫瘤組織中，EphA7蛋白表達陽性68例(81.9%)。對照組30例中EphA7陽性表達7例(23.3%)。EphA7蛋白陽性表達率胃癌組織高于癌旁正常組織(P＜0.05)(表1)。

表1 EphA7蛋白在胃癌組織中的表達情況(例，%)

2.2 EphA7蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

EphA7蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系(表2)。

表2 EphA7蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系(例，%)

2.3 術前血漿腫瘤標志物濃度與EphA7蛋白表達水平的關系

83例胃癌患者中45例行血清CA19-9、CEA檢測。EphA7蛋白陽性表達組術前血清CA19-9濃度［(315 500 ±45 700)U/L，n=36］高于陰性表達組［(94 300 ± 27 200)U/L，n=9］(t=2.259，P=0.038)。EphA7蛋白陽性表達組和陰性表達組血清CEA 濃度分別為(34.3 ±6.5)μg/L 和(23.5 ±5.9)μg/L，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.433，P=0.155)。E-phA7蛋白表達水平與血清CA19-9、CEA呈正相關性(表3)。

表3 EphA7蛋白表達與血清CA19-9、癌胚抗原(CEA)的關系

2.4 EphA7蛋白表達水平與患者生存期的關系

2.4.1 EphA7蛋白表達陽性組及陰性組的生存情況83例患者中EphA7蛋白表達陽性者68例，陰性者15例。Kaplan-Meier生存分析顯示，83例患者1、2、3、5 年生存率分別為 79.2%、66.7%、57.5% 和 20.3%，平均生存期為37.8個月。其中EphA7蛋白表達陰性組1、3、5 年生存率分別為 91.4%、75.6% 和 39.5%，平均生存期為48.3個月;EphA7蛋白表達陽性組1、3、5 年生存率分別為 67.5%、35.2% 和 12.3%，平均生存期為22.7個月。EphA7蛋白表達陽性組與陰性組生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.568，P=0.001)。

2.4.2 EphA7蛋白表達水平對患者預后的影響 單因素分析顯示，患者年齡、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期和EphA7蛋白表達水平與患者預后有關，而性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤大體分型與患者預后無關。對單因素篩選出的顯著性變量，納入Cox模型進行多因素生分析，結果顯示EphA7蛋白表達水平、淋巴結轉移和TNM分期是胃癌獨立的預后因素。

3 討論

3.1 EphA7蛋白在胃癌中表達及其與臨床病理特征的相關性

EphA7是酪氨酸蛋白激酶受體家族(receptor tyrosine kinase，RTK)中的一員，定位于染色體6q16.1靠近斷裂點的位置，在人體內分布廣泛，參與了細胞生長、分化、胚胎發(fā)育及細胞內信號轉換等過程中具有相當重要的生理功能［7］。近年研究發(fā)現EphA7在許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能是反映惡性腫瘤進展、生物學行為及預后的重要生物學標志物。Surawska等［8］研究發(fā)現，EphA7在肺癌組織中的表達水平較正常肺組織中上升了4.6倍，而Hafner等［9］研究顯示結腸癌組織中EphA7表達水平較正常結腸癌組織中下降了5.8倍。本研究結果顯示，E-phA7蛋白陽性表達率為81.9%，相應的癌旁組織陽性表達率為23.3%，陽性染色定位于胃癌細胞質和血管內皮細胞中;與癌旁組織比較，EphA7蛋白的表達陽性率在胃癌組織中明顯上調。有研究顯示，胃癌腫瘤Borrmann大體分型、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、切緣癌殘留、治療方式等是影響患者生存率的重要因素［3，10］。本研究顯示，EphA7 蛋白表達與腫瘤分化程度呈負相關性，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期呈正相關性。

3.2 EphA7蛋白表達與胃癌侵襲性生長、淋巴結轉移的關系

EphA7蛋白在癌組織中的表達水平與惡性腫瘤的侵襲性及預后有關［1～6，8～10］。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉移的形態(tài)學基礎，是促進腫瘤轉移的重要外部因素，它不僅為腫瘤提供充足的營養(yǎng)，而且為轉移的腫瘤細胞提供了通道。大量的生物化學和遺傳學證據提示了Eph/Ephrin信號傳導通道在血管發(fā)生、發(fā)育過程中起著關鍵作用［11］。本研究中，EphA7蛋白高表達于腫瘤細胞和血管內皮細胞中，同時顯示與胃癌淋巴結轉移呈正相關。由此可見，EphA7蛋白主要影響胃癌的浸潤及轉移，通過檢測胃癌細胞EphA7蛋白表達水平，可初步判斷胃癌生物學行為的惡性程度。

3.3 EphA7蛋白表達水平與術前血漿腫瘤標志物的相關性

CA19-9是診斷和檢測消化道惡性腫瘤的有效腫瘤標志物之一，而且CA19-9水平進行性升高在臨床癥狀出現之前，可作為術后判斷腫瘤復發(fā)的指標［12］。目前，尚未見EphA7蛋白表達與血清CA19-9關系的詳細報道。本研究顯示，EphA7蛋白陽性表達組術前血清CA19-9濃度高于陰性表達組，血清CEA濃度也高于陰性表達組，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義;EphA7蛋白表達與血清CA19-9、CEA濃度呈正相關性。

3.4 EphA7蛋白表達水平與胃癌預后的相關性

EphA7在不同腫瘤中發(fā)揮的作用有可能不同，而這種可能與EphA7能和不同的Ephrin配體結合后產生的雙向信號調節(jié)有關，提示EphA7可能主要作為1種致癌蛋白參與了腫瘤細胞的惡性轉化過程，參與細胞周期調節(jié)及參與血管形成作用［1，8～11］。而腫瘤組織中高水平的EphA7蛋白必然導致腫瘤細胞凋亡的抑制、細胞周期的改變，引起腫瘤細胞增殖過旺，加之E-phA7蛋白高表達引起腫瘤組織新生血管增多，血液供應豐富，更加引起腫瘤細胞增殖過旺，這樣就導致腫瘤形成［3，6］。已形成的腫瘤組織因EphA7蛋白進一步表達，使該腫瘤細胞不易凋亡，有惡性繁殖的條件及傾向，故其臨床預后較差［13］。研究表明，結腸癌中 E-phA7低表達與患者性別、癌細胞分化程度、腫瘤發(fā)生部位等有關，而與患者年齡無關［4，9］。而胃癌中 E-phA7高表達與患者年齡、腫瘤分期有關，術后5年生存率有顯著差異，提示EphA7蛋白表達可以影響腫瘤生物學行為，可使其更易發(fā)生局部與血行復發(fā)轉移等惡性行為，是預后不良的指征［3，10，11，13，14］。本組資料顯示，EphA7蛋白表達是胃癌患者預后差的標志，EphA7蛋白表達陽性組 1、3、5年生存率分別為67.5%、35.2%和12.3%，顯著低于陰性組 1、3、5 年生存率;多因素分析顯示，EphA7蛋白表達水平、淋巴結轉移和TNM分期為胃癌根治術后獨立的預后因素，EphA7蛋白表達陽性提示預后不良。

［1］張水軍，張 弓，趙永福，等.原發(fā)性肝癌細胞中EphA7蛋白的表達及其臨床意義〔J〕.中華外科雜志，2010，48(1):53.

［2］Dawson DW，Hong JS，Meyer S，et al.Global DNA methylation profiling reveals silencing of a secreted form of Epha7in mouse and human germinal center B-cell lymphomas〔J〕.Oncogene，2007，26(3):4243.

［3］王建東，李國立，馬恒輝，等.受體酪氨酸激酶EphA7基因在胃癌中的表達及意義〔J〕.醫(yī)學研究生學報，2009，22(3):260.

［4］Wang J，Kataoka H，Suzuki M，et a1.Downregulation of E-phA7 by hypermethylation in colorectal cancer〔J〕.Oncogene，2005，24(36):5637.

［5］Tsuboi M，Moil H，Burmi T，et a1.Secreted form of EphA7 in lung cancer〔J〕.Int J Oncol，2010，36(3):635.

［6］Guan M，Xu C，Zhang F，et a1.Aberrant methylation of E-phA7 in human prostate cancer and its relation to elinopathologle features〔J〕.Int J Cancer，2009，124(1):88.

［7］Ciossek T，Millauer B，Ullrich A，et al.Identification of alternatively spliced mRNAs encoding variants of MDK1，a novel receptor tyrosine kinase expressed in the murine nervous system〔J〕.Oncogene，1995，10(1):97.

［8］Surawska H，Ma PC，Salgia R.The role of ephrins and eph receptors in cancer〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2004，15(6):419.

［9］Hafner C，Schmitz G，Meyer S，et al.Differential gene expression of Eph receptors and ephrins in benign human tissues and cancers〔J〕.Clin Chem，2004，50(3):490.

［10］Wang J，Li G，Ma H，et al.Differential expression of EphA7 receptor tyrosine kinase in gastric carcinoma〔J〕.Hum Pathol，2007，38(11):1649.

［11］Yaneopoulos GD，Davis S，Gale NW，et al.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation〔J〕.Nature，2008，407(6801):242.

［12］Park IJ，Choi GS，Jun SH.Prognostic value of serum tumor antigen CA19-9 after curative resection of colorectal cancer〔J〕.Anticancer Res，2009，29(10):4303.

［13］Wang LF，Fokas F，Juricko F，et al.Increased expression of EphA7 correlates with adverse outcome in primary and recurrent glioblastoma multiforme patients〔J〕.BMC Cancer，2008，25(1):79.

［14］Brantley DM，Cheng N，Thompson EJ，et al.Soluble EphA receptors inhibit tumor angiogenesis and progression in vivo〔J〕.Oncogene，2002，21(10):7011.