附子總生物堿中烏頭堿\\新烏頭堿\\次烏頭堿在大鼠體內的藥動學研究*

　　摘要：目的：研究口服附子總生物堿后烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿在大鼠體內的藥動學特征。方法：口服給予大鼠附子總生物堿后，斷尾取血，采用甲醇沉淀冷凍干燥法處理血漿樣品。采用HPLC-MS/MS分析方法檢測烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的血藥濃度。藥時數據用中國藥理學會3p97藥代動力學程序計算主要藥動學參數。結果：本實驗建立的用于檢測大鼠血漿的HPLC-MS/MS分析方法，其靈敏度高、專屬性強、穩定性好，能很好的符合生物樣品分析的要求。烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的藥動學曲線經擬合均符合口服給藥的二室模型。烏頭堿主要藥動參數：T1/2α=3.32±1.56min，T1/2β=886.61±242.14min，AUC=86.558±9.462mg?L-1?min-1，Tpeak=6.989±1.546min，Cmax=83.549±10.459ng?mL-1。新烏頭堿主要藥動參數：T1/2α=15.4989±4.8712min，T1/2β=1255.808±684.891min，AUC=297.212±74.642ng?mL-1?min，Tpeak=15.782±7.541min，Cmax=202.983±30.781ng?mL-1。次烏頭堿主要藥動參數：T1/2α=125.482±51.654min，T1/2β=1007.757±349.485min，AUC=241.206±9.147ng?mL-1?min，Tpeak=16.765±5.478min，Cmax=164.302±20.891ng?mL-1。結論：灌胃給予附子總生物堿后烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿在大鼠體內的過程符合口服二室模型。
　　關鍵詞：附子；附子總生物堿；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿；HPLC-MS/MS；毒代動力學
　　中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）03-0049-04
　　烏頭類有毒中藥如川烏、草烏、附子等是中醫臨床常用的有毒中藥。已有研究表明烏頭類有毒中藥具有強心［1~5］、抗休克［6］、抗心律失常［7］、抗炎鎮痛［8~9］、致心律失常［10］抑制呼吸中樞、興奮迷走中樞等作用，烏頭堿類生物堿如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿既是烏頭、附子中的主要有毒成分，也是發揮部分藥效的主要有效成分。近年來烏頭堿類生物堿的毒理學研究越來越深入，如已有文獻報道了烏頭堿對結腸間質細胞、神經細胞、心肌細胞、大鼠胚胎等的影響機制［11~13］，但體內過程的研究相對較少。
　　由于烏頭堿類生物堿毒性大，動物血漿內的含量較低，對熱不穩定，容易發生水解。有研究發現烏頭堿在甲醇溶液中不穩定，常溫下放置短時間即可產生新的物質［14~15］。故本實驗運用高靈敏的HPLC-MS/MS檢測樣品中烏頭堿類生物堿（烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿）的含量，采用甲醇沉淀凍干法處理血漿樣品，對口服給予附子總生物堿后烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿在大鼠體內的藥動學特點進行研究。
　　1實驗材料
　　1.1實驗儀器API3000質譜儀（AB公司）；Dionex高效液相色譜儀；WH-1微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）；TCL-16g型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；FD-1B-50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；
　　1.2試劑與試藥烏頭堿（Aconitine，A），中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110720-200410；新烏頭堿（Mesaconitine，MA），中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110798-200404；次烏頭堿（Hypaconitine，HA），中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110799-200505；附子雙酯型生物堿，為本課題組化學組提供，經HPLC測定生物堿含量為：烏頭堿：0.0778mg/mL，新烏頭堿：0.978mg/mL，次烏頭堿：0.3274mg/mL。甲醇為色譜純，三乙胺、二氯甲烷、鹽酸等為分析純，水為雙蒸水。
　　1.3實驗動物SD大鼠，雌雄各半，成都中醫藥大學動物實驗中心提供（實驗動物生產許可證號：08-049），體重（280±20）g，健康合格，檢疫后備用。
　　2實驗方法
　　2.1檢測條件
　　2.1.1高效液相色譜條件色譜柱：PhenomenexGeminiC18，Φ250mm×Φ4.6mm，5μm；預柱：Phenomenex；ChromGuardHPLCC18Column，Φ4mm×3mm，5μm，流動相：甲醇-水-三乙胺=80∶20∶0.1流速：0.6mL?min-1；柱溫：40℃；進樣量：20μL。
　　2.1.2質譜條件離子源：ESI，正離子MRM掃描，CUR13.0L?min-1，CAD6.0L?min-1，IS：5500V，TEM：450℃，GS1：33.0L?min-1，GA2：33.0L?min-1，DP：100.0V，FP400.0V，EP：11.0V，CE：60.0V.
　　MRM檢測：烏頭堿：646.0/586.0，646.0/105.0；次烏頭堿：616.3/338.5；新烏頭堿：632.0/105.0
　　2.2對照品溶液的配制分別精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，用二氯甲烷制成每1mL含0.135mg，0.104mg和0.132mg的溶液。再取一定量溶液以二氯甲烷稀釋成濃度分別為1.35、1.04和1.32μg/mL的對照品溶液保存在4℃的避光冰箱中備用。
　　2.3樣品處理方法取血漿樣品200μL置于離心管中，按1∶4的比例加入甲醇800μL，渦旋振蕩3min，沉淀蛋白，按10000r?min-1離心10min，取上清液，加入雙蒸水配成甲醇濃度為20％的溶液，置于凍干瓶中冷凍干燥，于檢測前向凍干瓶中加入400μL甲醇，旋渦震蕩3min，按10000r?min-1離心5min，取上清液進樣測定。
　　2.4毒代動力學實驗取SD大鼠，6只，雌雄各半，體重（280±20）g。灌胃附子總生物堿，折算成烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿劑量為：烏頭堿0.3112mg/kg，新烏頭堿3.912mg/kg，次烏頭堿1.3096mg/kg，灌胃后分別于3、5、10、20、30、60、90、120、240、360、540、720min斷尾取血0.5mL，肝素鈉抗凝，離心后取血漿，按上述“2.3”處理樣品，將處理后樣品按“2.1”項下檢測條件測定樣品。
　　3實驗結果
　　3.1方法專屬性取空白血漿、空白血漿+對照品、血漿樣品按“2.3”處理，與對照品，按“2.1”項下檢測條件測定，考察方法的專屬性。結果見圖1~3。
　　結果表明，空白血漿MRM掃描圖中與空白血漿+對照品和血漿樣品MRM掃描圖比較無相關離子檢測峰存在，說明專屬性良好。
　　3.2標準曲線及靈敏度分別取大鼠空白血漿200μL，加入適當的濃度的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液10μL配制成用于繪制標準曲線的血漿樣品，這些血漿樣品分別按“2.3”方法處理后進樣測定，記錄峰面積。以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品在血漿樣品中的濃度（c）對峰面積（Y）進行加權（1/c2）最小二乘法計算。結果表明烏頭堿在27~270ng/mL范圍內成良好的線性關系，線性方程為：Y=273.56c-13242.8，r=0.9974，LOD及LOQ分別為4.5、9ng/mL；新烏頭堿在10.4~312ng/mL范圍內成良好的線性關系，線性方程為：Y=159.23c-3038.1，r=0.9953，LOD及LOQ分別為5.2、10.4ng/mL；次烏頭堿分別在13.2~132ng/mL和132~518ng/mL范圍內成良好的線性關系。線性方程分別為Y=2.1433c+82.304，r=0.9984和Y=10.4033c-614.043，r=0.9963，LOD及LOQ分別為6.6、13.2ng/mL。
　　
　　3.3回收率分別取大鼠空白血漿200μL加入一定量的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液，分別配制成54、27、10.8，62.4、20.8、10.4，396、132、13.2ng/mL濃度的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿血漿樣品，按“2.3”處理后，分別測試，計算回收率。烏頭堿的血漿樣品的回收率分別為97.89±2.63％、95.63±3.56％和91.48±5.00％；新烏頭堿的血漿樣品的回收率分別為97.31±2.27％、95.24±3.56％和94.71±3.46％；次烏頭堿的血漿樣品的回收率分別為97.47±3.23％、97.73±3.89％和96.97±5.68％。均符合定量分析的要求。
　　3.4精密度和準確度分別取大鼠空白血漿200μL加入一定量的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液，分別配制成54、27、10.8、62.4、20.8、10.4、396、132、13.2ng/mL濃度的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿血漿樣品，按“2.3”處理后，分別測試，進行日內精密度試驗，另外取上述制備好的樣品，間隔時間做3日內的日間精密度試驗。烏頭堿：日內精密度為3.6％、4.2％、5.5％；日間精密度為2.4％、2.7％、4.5％。新烏頭堿：日內精密度為1.9％、4.1％、3.7％；日間精密度為2.4％、3.1％、4.4％。次烏頭堿：日內精密度為2.9％、3.1％、2.8％；日間精密度為2.6％、3.3％、4.7％。結果精密度符合要求，測定方法可靠。
　　3.5毒代動力學參數按2.4項下的實驗方法，分別得到不同時間點的血藥濃度。將藥時數據用中國藥理學會3p97藥代動力學程序進行自動擬合處理。以理論血藥濃度值與實驗測定值的相關系數最大和AIC最小作為判斷標準。結果：烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的藥動學曲線經擬合均符合口服給藥的二室模型，藥物濃度-時間曲線見圖4，主要藥動學參數見表1。將烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿按時間點繪制藥-時曲線圖，對比體內代謝的變化，見圖7。
　　4討論
　　研究表明，在灌胃給藥后10min，烏頭堿即達最高血藥濃度，此后血藥濃度快速下降，在30min下降到10min的一半左右，此后在60、360min出現了多峰。在灌胃給藥后20min，新烏頭堿即達最高血藥濃度，此后血藥濃度總體緩緩下降，但在90、360min出現了多峰。在灌胃給藥后20min，次烏頭堿即達最高血藥濃度，此后血藥濃度快速下降，在30min下降到20min的一半左右，此后在60、120min出現了多峰。提示烏頭堿類雙酯型生物堿口服后吸收很快入血，且分布迅速，然后出現多峰現象，血藥濃度緩慢下降。
　　因為烏頭堿類雙酯型生物堿毒性、藥效相似，故將新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿同一時間點的血藥濃度相加，繪制藥時曲線，觀察大鼠口服烏頭堿類雙酯型生物堿后總濃度在血液中的動態變化（見圖5）。
　　結果表明：在灌胃給藥后20min，烏頭堿類雙酯型生物堿總血藥濃度達最高，此后血藥濃度快速下降，在30min下降到20min的3/4左右，此后在60、120、240min出現了多峰。總體趨勢是30~360min血藥濃度相對穩定，然后呈緩緩下降趨勢。提示大鼠口服附子總生物堿后，吸收迅速，然后快速分布，30~360min保持相對穩定血藥濃度，而后血藥濃度呈緩緩下降趨勢。
　　預實驗發現，超過本研究所用給藥劑量，多數動物在30min之內死亡，死亡前出現喘息、唾液分泌過多、鼻分泌物增多，尿失禁現象。死亡后解剖動物，肉眼觀察發現肝臟呈黑紫色，肺表面出現大量出血點。按以上劑量給藥，動物雖然不致死亡，但在15min左右出現了喘息、呼吸頻率減慢、鼻分泌物增多、運動失調、異常運動、俯臥、震顫，尿失禁，唾液分泌過多、流涎等現象，這些現象在30min后逐漸得到緩解，呼吸漸趨正常，自主活動也較前嚴重中毒時增加但仍有中毒的反應存在。
　　[KH*3D][XC20110307.tif;%100%110][HT6H]
　　圖60~30min總生物堿藥-時曲線圖[KH*3]
　　觀察烏頭類有毒中藥生物堿30min內的藥-時曲線（見圖6），可見烏頭類有毒中藥生物堿總量在20min內快速上升，然后快速下降，特別是烏頭堿和次烏頭堿表現更為明顯。提示動物在30min內出現的中毒反應與烏頭類有毒中藥生物堿總量的血藥濃度快速上升有關，而30min后逐漸緩解與其血藥濃度快速下降有關。其后烏頭類有毒中藥生物堿總量的血藥濃度出現多峰現象，并在一定范圍內相對平穩，使動物在一段時間內保持輕度中毒的狀態。證實了烏頭類有毒中藥生物堿的血藥濃度與中毒反應的產生具有直接相關性。
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　　（收稿日期：2010-12-07）