膽囊癌中骨橋蛋白和MMP-9的表達及其意義

[摘要] 目的 了解膽囊癌組織中骨橋蛋白和MMP-9的表達及其意義。方法 選擇正常的膽囊組織10例、膽囊腺瘤組織10例和膽囊癌組織40例，運用免疫組織化學方法，檢測OPN和MMP-9的表達水平，對OPN和MMP-9表達的相關性進行分析研究。結果 膽囊癌組織中OPN和MMP-9的表達水平明顯高于膽囊組織和膽囊腺瘤組織（P＜0.05），其中在有轉移的膽囊癌組織中OPN的表達水平明顯高于沒有轉移的膽囊癌組織（P＜0.05）。膽囊癌組織中OPN和MMP-9的表達具有一致性（P＜0.05）。結論 OPN與MMP-9的表達情況與膽囊癌浸潤、轉移發生有密切的關系，本實驗結果證實MMP-9和OPN均陽性表達時對膽囊癌轉移及預后有重要的預測價值。

[關鍵詞] 膽囊癌；腫瘤轉移；骨橋蛋白；MMP-9；免疫組化

[中圖分類號] R735.8 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）31-61-02

Expression of Osteopontin（OPN）and MMP-9 in Gallbladder Cancer and Its Clinical Significance

XU Guixiang1 WANG Zhenxu1 XU Zhun2 HU Jingjin1 WANG Lin1 TAO Ketao1 HE Songxiong1 ZHANG Guixin1 AN Xin3 XUE Bingchuan3

1.Department of General Surgery，Qingdao Fuwai Cardiovadcular Hospital，Qingdao 266034，China；2.Qingdao Foreign Language College，Qingdao 266000，China；3.Department of General Surgery，the Third Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030053，China

[Abstract] Objective To explore expression of osteopontin and MMP-9 in gallbladder cancer and its clinical significance. Methods The expression of osteopontin and MMP-9 was detected by immunohistochemical method in 40 cases of gallbladder cancer，10 cases of normal gallbladder and 10 cases of gallbladder adenoma. The relationship between the expression of osteopontin and MMP-9 was analyzed. Results The positive expression rates of osteopontin and MMP-9 in gallbladder cancer tissues were significantly higher than that in normal gallbladder tissues and gallbladder adenoma tissues（P＜0.05）. The positive expression rates of osteopontin in patients of NEVIN Ⅳ，Ⅴstages were higher than that in patients of NEVIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ stages）（P＜0.05）. The expression of osteopontin was positively correlated with the expression of MMP-9（P＜0.05）. Conclusion Both osteopontin and MMP-9 are significantly related to the metastasis of gallbladder cancer，and overexpression of both osteopontin and MMP-9 has a predictive value for metastasis and recurrence.

[Key words] Gallbladder cancer；Tumor metastasis；Osteopontin；MMP-9；Immunohistochemistry

筆者采用免疫組織化學方法，檢測骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）在膽囊良、惡性病變中的表達，旨在探討兩者在膽囊癌（GBC）的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集青島阜外心血管病醫院和山西醫科大學第三醫院2000年1月～2010年7月的40例膽囊癌標本，均由醫院病理科醫師從病理學角度予以證實，并且常規按照NEVIN分期方法，將40例膽囊癌標本分檔為：Ⅰ期5例、Ⅱ期2例、Ⅲ期10例、Ⅳ期10例，Ⅴ期13例。研究所選的膽囊癌標本均于癌灶中央位置進行常規取材，后用0.5%甲醛固定，常規石蠟包埋。隨機選取2000年1月～2010年7月正常的膽囊組織和膽囊腺瘤各10例作為對照組。納入研究對象的患者術前均未進行抗腫瘤和抗炎治療。

1.2 方法和試劑

OPN、MMP-9的檢測全部采用免疫組化S-P（鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶）法。選用購自美國Chemicon公司的抗OPN兔抗人多克隆抗體，即用型鼠抗人MMP-9單克隆抗體、超敏SP（鼠）免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。操作步驟：將包埋石蠟的膽囊組織切成厚度為5μm的片→常規脫蠟至水→Tris緩沖液洗3次，每次為5min→3%H2O2浸泡10min→Tris緩沖液緩慢洗3次，每次為5min→在濃度為10mmol/L的枸櫞酸（pH6.0）液中煮沸5min共2次→Tris緩沖液洗3次，每次為5min→10%正常羊血清封閉→滴加1抗（即兔抗人OPN蛋白抗體、鼠抗人MMP-9單克隆抗體），恒溫箱內37℃放置1h→Tris緩沖液洗共3次每次為5min→用Supervision為二抗，37℃下結合30min→Tris緩沖液洗3次，每次5min→DAB室溫下顯色10min→流水沖洗5min→蘇木精復染→封片。以Tris緩沖液作為一抗定為陰性對照。

1.3 結果判斷標準

在光鏡下觀察，胞質或胞膜有棕黃色染色顆粒為陽性細胞，基質染色除外。所有病理切片均由2位資深病理醫師閱片、診斷，顯色細胞數＜30%者為陰性（-）；著色細胞數≥30%者為陽性（+）。

1.4 統計學分析

應用SPSS11.5統計軟件分析，卡方檢驗及相關性檢驗（α=0.05為檢驗水準）。

2 結果

2.1 各組織中OPN和MMP-9的表達情況

在40例膽囊癌組織中呈陽性表達的分別有33例和29例，10例膽囊腺瘤組織中呈現陽性表達的分別有3例和2例，OPN、MMP-9在10例正常膽囊組織中呈陽性表達的分別有3例和1例。OPN和MMP-9在正常膽囊黏膜組織、膽囊腺瘤組織和膽囊癌組織中陽性表達總體來說均有明顯的差異（兩者的P值均小于0.01），兩者在膽囊癌組織中的陽性表達均明顯升高。

2.2 OPN、MMP-9在細胞中表達的定位觀察

OPN的表達主要定位于膽囊癌胞質中，少數癌細胞的胞膜亦同時陽性；MMP-9主要定位于細胞漿。見圖1、2。

2.3 膽囊癌組織中OPN、MMP-9表達與腫瘤臨床及病理學特征之間的關系

OPN、MMP-9的表達在有轉移的NEVIN Ⅳ、Ⅴ期患者中和在沒有轉移的NEVINⅠ、Ⅱ、Ⅲ期患者中的表達有差異（P＜0.05），有轉移的患者中OPN的表達明顯升高，膽囊癌組織中OPN、MMP-9的表達均與患者的年齡、性別（P＞0.05）無明顯相關性。見表2。

2.4 膽囊癌組織中骨橋蛋白和MMP-9表達的相關性分析

膽囊癌組織中OPN和MMP-9表達具有相關性（P＜0.05）。

3 討論

OPN是一種由多種細胞表達和分泌的磷酸糖蛋白，Senger[1]于1979年研究發現OPN參與細胞黏附、趨化、應激依賴的血管新生、凋亡的阻抑活動。已經有研究證實OPN在胃癌、肝癌等惡性腫瘤組織中均有不同程度的表達。本實驗通過對OPN在10例膽囊腺瘤、10例正常膽囊組織和40例膽囊癌切除標本中的表達情況，發現其在腫瘤的侵襲轉移中起著重要作用，但在轉移早期或中后期的作用孰大孰小尚不確定，國內魏少峰等[2]的實驗得出，OPN可能在惡性腫瘤早期侵襲轉移過程中起作用。基質金屬蛋白酶（MMP）具有鋅離子依賴性內肽酶，MMP-9蛋白為其中的代表，表達于腫瘤細胞膜的表面，促進腫瘤細胞的轉移的結構和功能調整，被激活后成為Ⅳ型膠原酶，降解并且破壞近腫瘤表面的細胞外基質中Ⅳ、Ⅴ型膠原及明膠，促使腫瘤細胞向周圍侵潤，最終引致腫瘤的侵襲和轉移[3]。Rangaswami等[4]研究亦證實MMP-9活化有賴于OPN的表達增強，而MMP-9的活化加速了腫瘤的擴散。OPN和MMP-9兩者關系的研究張東濤等[5]證實OPN與胃癌的侵襲轉移有關；陳發龍等[6]證實了OPN和MMP-9在肝癌組織中的表達具有相關性。在40例膽囊癌組織中，27例兩者均陽性表達，而這27例中有近19例發生了轉移；其中5例兩者均陰性表達的病例中，均沒有發生轉移。OPN和MMP-9比較有顯著性差異，本實驗研究表明，骨橋蛋白和MMP-9表達可能具有相關的一致性。查閱相關文獻結合本實驗結果，本人及相關實驗人員一致認為，聯合檢測OPN和MMP-9，在膽囊癌轉移的早期發現及判斷預后中可能存有重要價值。

[參考文獻]

[1] Senger DR，Wirth DF，Hynes RO. Transformed mammalian cells secrete specific proteins and phosphoproteins[J]. Cell，1979，16（4）：885.

[2] 魏少峰，郜玉峰，李旭，等. 骨橋蛋白和P21在原發性肝癌中的表達及其臨床意義[J]. 實用肝臟病雜志，2005，8（2）：73-76.

[3] Shirabe K，Shimada M，Kajiyama K，et al. Expression of matrix etalloproteinase-9 in surgically resected intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Surgery，1999，126（5）：842-846.

[4] Rangaswami H，Bulbule A，Kundu GC. Nuclear factor-inducing kinase plays a crucial role in osteopontin-induced MAPK/Ikappa-Balpha kinase-dependent nuclear factor kappaB-mediated pro-matrix metalloproteinase-9 activation[J]. J Biol Chem，2004，279（37）：38921-38935.

[5] 張東濤，袁靜，楊力，等. 骨橋蛋白在胃癌中的表達及胃癌侵潤轉移的關系[J].

中華腫瘤雜志，2005，27（3）：167-169.

[6] 陳發龍，陳軍，曾麗霞. 骨橋蛋白與MMP-9在肝細胞癌中的表達及其臨床意義[J]. 中國腫瘤臨床，2007，34（20）：1160-1163.

（收稿日期：2011-08-16）