循環內皮細胞計數與先心病繼發肺動脈高壓可逆性的關系

【摘要】 目的 尋找循環內皮細胞與先天性心臟病繼發肺動脈高壓的關系。方法 選擇先心病合并肺高壓患者，術前利用流式細胞儀測外周血中循環內皮細胞的數量，并彩超測量肺動脈壓力、查動脈血氣氧飽和度。術后隨訪半年，根據患者肺動脈壓力是否下降及動脈血氣改善與否分為可逆性組和不可逆組，比較可逆組、不可逆組、健康對照組的循環內皮細胞計數。結果 CEC計數在不可逆組顯著高于可逆組和健康對照組。結論 循環內皮細胞計數可預測先心病患者繼發肺動脈高壓是否可逆。

【關鍵詞】 循環內皮細胞； 肺動脈高壓； 內皮細胞； 流式細胞術

臨床發現先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）繼發肺動脈高壓（pulmonary artic hypertension，PAH）患者在進行矯正手術之后，一部分肺動脈壓力明顯下降，動脈血氣氧飽和度明顯改善，而另一部分無明顯變化。左向右分流的復雜先心病合并肺動脈高壓，決定其是否可逆性的機制還不清楚。PAH的不可逆性依據術前檢查很難預測。循環內皮細胞（circulating endothelial cells，CEC）是目前唯一可作為活體組織中反映血管內皮細胞損傷的直接而特異的標志物，并且其數量與其他內皮功能標記物水平相關聯（如血流所致的血管擴張、血管假性血友病因子、組織纖維蛋白酶原激活劑）。研究表明不可逆性肺動脈高壓存在著血管內皮損傷^［1］。筆者嘗試將CEC作為不可逆肺動脈高壓患者的一種新的生物標記物。現將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 筆者所在醫院收治先心病繼發肺動脈高壓患者26例，其中室間隔缺損18例，房間隔缺損5例，動脈導管未閉3例。同時選擇健康對照組患者10例，病例組及對照組均無冠心病、心肌梗死、呼吸系統疾病、肝病、腦血管疾病、高血壓、高脂血癥、腎病、糖尿病及其它自身免疫性疾病。病例組及對照組在年齡、體重、性別均無明顯差異。術前抽取外周血，對CEC數量進行檢測，采用心臟彩超估測肺動脈壓力。依據術后6個月的肺動脈壓力是否下降至正常將患者回顧性地分為兩組，16個正常肺動脈壓力患者為可逆性PAH組，10個患者由于肺血管抵抗肺動脈壓力仍然高，為不可逆PAH組。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗儀器及試劑 流式細胞儀，離心機，FITC標記的鼠抗人CD31、CD3抗體，percoll分離液，Hank液及EDTA采血管、抗凝劑等。

1.2.2 標本采集 用EDTA負壓采血管采集先心病繼發肺動脈高壓患者和健康對照組空腹血液各50 μl，分離CEC備用。實驗前將需用物品徹底清潔干凈，配制實驗所需試劑，按各類試劑要求的條件貯存備用。

1.2.3 CEC的提取 采用Percoll密度離心法提取標本血CEC：（1）EDTA抗凝管抽取外周血取50 μl于試劑盒中。（2）加鼠抗人CD31及CD3 PE 10 μl于上述試劑盒中，混勻，避光保存10～15 min。（3）加溶血劑1 ml于試劑盒中，混勻，避光10 min。（4）以1000轉/min離心試劑盒5 min，棄去上清液。（5）洗滌：加PBS液1 ml于試劑盒中，混勻，1000轉/min離心5 min，棄上清。加PBS液0.5 μl于試劑盒中，混勻，上機檢測。（6）外周血CEC計數：在裝備有488 nm氫離子激光光源的流細胞儀上檢測。根據前向角光散射（forward light scatter）的不同，每例標本收集10 000個細胞，根據陰性對照設定門，以檢測CD31和CD3陽性細胞的百分比；分選CD31和CD3陽性門內的細胞。采用CELLQUEST軟件分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS 12.0統計軟件進行統計學分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對CEC數目進行方差分析，對照組和可逆性PAH組的外周血CEC計數差異無統計學意義（P>0.05）；相反，不可逆性PAH組CEC計數卻顯殊增高，與對照組和可逆性PAH組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。可逆組與不可逆組的年齡存在差異（P<0.05）。見表1，表2。

表1 CEC計數比較（x±s）

注：與對照組比較，^{*>/sup>P<0.05；與可逆組比較，△>/sup>P<0.05}

表2 患者一般臨床特征比較

3 結論

依據肺動脈壓力下降與否將患者分為可逆組與不可逆組，CEC計數在不可逆組顯著高于可逆組，也高于同期對照組。CEC計數可以作為預測先心病繼發肺高壓可逆性的一種生物標記物。

4 討論

肺動脈高壓是左向右分流型先心病常見且嚴重的并發癥，以肺血管阻力進行性升高和右心功能進行性衰竭為主要特征，是導致先心病患者死亡的重要原因之一，預后很差^［2，3］。先心病繼發肺動脈高壓發生機理尚未完全明確， 晚近認為異常血流動力學引起的肺血管重建和肺血管內皮細胞損傷、功能不全在肺動脈高壓的發生、發展過程中起重要作用。肺血流量增加和壓力升高的機械作用引起肺血管內皮受損，可能啟動了肺動脈高壓的形成過程。

循環內皮細胞（CEC）是機體在生理或病理情況下指外周血中測得的血管內皮細胞（vascular endothelial cells， VEC），其數量的變化可反映血管內皮受損的程度，是目前唯一可作為活體組織中反映VEC損傷、重構和功能失調的直接而特異的標志物^［4］。生理狀況下，機體細胞不斷新陳代謝，衰老的內皮細胞脫落進入血液循環，其數量一般較少。當機體由于心血管疾病、缺氧、損傷、應激等導致血管受損，大量內皮細胞衰老、死亡、脫落進入血液循環，導致循環血中內皮細胞數量急劇增多，形態多樣。CEC的數量與年齡、循環祖細胞的數量沒有關系，所以循環內皮細胞的數量可能作為血管反應性的獨立評價因子。因此，CEC作為機體內直接反應血管內皮損傷的特異而直接的指示物^［5］，在診斷和判斷預后方面有明顯的優勢，可以深入的探討疾病的病理生理機制，備受國內外學者的關注。

在國內外，近年來的研究發現在冠心病、心肌梗死、惡性腫瘤等患者的外周血中CEC數量明顯升高。同時研究還表明CEC決定因素比較單一，盡管它在很多種疾病中都會出現數量的變化，但基本上都是由于各種因素作用到血管內皮，導致血管內皮損傷，從而導致CEC的數量發生改變。但是，有關CEC在肺動脈高壓中的研究很少。在國外，1993年，Bull^［6］的研究表明CEC計數與各種原因導致的成人肺動脈高壓的肺壓力相關。2009年，David^［7］的研究表明先心病繼發肺動脈高壓患者外周血中CEC數量明顯升高，并且外周血CEC計數能夠預測先心病合并肺動脈高壓的可逆性，但是該研究還需要更長時間的隨訪和更大樣本的研究。在國內，有關CEC與肺動脈高壓的研究甚少，CEC與先心病繼發肺動脈高壓關系的研究還沒有報道。

基于以上觀點，由于先心病繼發肺動脈高壓肺血管的高壓力、高循環狀態，肺血流對血管內皮產生的剪切力，引起肺血管內皮受損。而CEC數量變化可以反映血管內皮的受損程度。CECs計數作為內皮損傷和/或修復的指標，能評價先心病繼發不可逆性肺高壓患者的血管再生能力。因此我們預計循環血中CEC計數會增加，并且其數量與受損程度正相關。于是我們假設將CEC作為肺動脈血管受損程度的生物標記物，來預測肺動脈高壓的可逆性，找出鑒別先心病合并肺動脈高壓是否可逆的一種非侵入性檢查方法。表1的結果顯示CEC數量在不可逆組顯著高于可逆組和對照組，這是由于不可逆性肺高壓患者肺血管內皮細胞損傷、重構、增殖更嚴重，表2的結果提示可逆組與不可逆組的年齡存在差異，這說明隨著年齡的增長，肺血管內皮的損傷逐步加重，肺動脈壓力進一步升高。

經流式細胞儀計數時^［8］，首先根據前向角光散射收集細胞，前向角光散射的強度與細胞大小有關，由于血小板直徑小于內皮細胞，其前向角光散射較小，因此在散點圖中與細胞碎片一起位于內皮細胞群的下方，易于分開（圖1）。由于去除了血小板的影響，因此提高了此方法的特異性。在散點圖中設定門，收集細胞10 000個。再在熒光直方圖中分析收集細胞中CD31陽性細胞的百分比（圖2）。

文獻報道循環內皮細胞的特異性不夠強，國內外學者已報道多種單克隆抗體，這是本方法的不足之處，因此，本實驗采用雙抗標記法，使用CD31抗體與CD3抗體標記提高了檢出細胞的特異性。

綜上所述，CEC作為不可逆性肺動脈高壓的一種非侵入性生物標記物，并且作為一種獨立評價因子，可能會成為一種在界定伴有肺動脈高壓的先心病患者的治療策略有價值的工具，具有廣泛的臨床應用前景。

參 考 文 獻

［1］ Levy M，Maurey C，Celermajer DS，et al.Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease.Am Coll Cardiol，2007，49：803-810.

［2］ Haworth SG，Reid L.A morphometric study of regional variation in lung structure in infants with pulmonary hypertension and congenital cardiac defect：a justification of lung biopsy.Br Heart J，1978，40：825-831.

［3］ Vongpatanasin W，Brickner ME，Hillis LD，et al.The Eisenmenger syndrome in adults. Ann Intern Med，1998，128：745-755.

［4］ GeimonenE，LaMonieaR，SpringerK，et al.Hanta-virus pulmonary syndrome- assoeiated hantaviruses contain conserved and funetional ITAM Signaling elements.J Virol，2003，77（2）：1638-1643.

［5］ Smadja DM，Gaussem P，Mauge L，et al.Comparison of Endothelial Biomarkers According to Reversibility of Pulmonary Hypertension Secondary to Congenital Heart Disease. Pediatr Cardiol，2010，31（5）：657-662.

［6］ Bull TM，Golpon H，Hebbel RP，et al.Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension.Thromb Haemost，2003，90:698-703.

［7］ David M，Smadja，Pascale Gaussem，et al.Circulating Endothelial Cells:a New Candidate Biomarker of Irreversible Pulmonary Hypertension Secondary to Congenital Heart Disease.Circulation，2009，119:374-381.

［8］ 遲喧，李宏偉.急性心肌梗塞患者外周血中循環內皮細胞含量的改變及凋亡的檢測.中國微循環，1999，3（2）：102-105.