大鼠腦血腫周圍Caspase-3的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系

[摘要] 目的 研究大鼠腦血腫周圍腦組織Caspase-3的表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡及探討二者之間的關(guān)系。 方法 60只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組（30只）和出血組（30只）。采用大鼠自體股動脈血注入尾殼核建立腦出血模型，分別于術(shù)后6、12、24、48、96 h 5個時間點取腦，應(yīng)用免疫組化方法檢測血腫周圍組織Caspase-3的表達(dá)，TUNEL法檢測血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 出血組大鼠腦血腫周圍組織Caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡明顯高于假手術(shù)組（P ＜ 0.01），Caspase-3的表達(dá)與血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性（r = 0.956，P ＜ 0.05）。 結(jié)論 Caspase-3、神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與了大鼠腦血腫周圍腦組織損傷的病理過程。

[關(guān)鍵詞] 腦出血；Caspase-3；神經(jīng)細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R743.34 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）03-0011-02

The association between expression of Caspase-3 and neuron apoptosis in perifocal tissue of intracerebral hemorrhage in rats

LI Jianshe1 BAI Hongying2

1.The Second Cadre Ward， Xinxiang Central Hospital， Xinxiang 453000， China; 2.Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450014， China

[Abstract] Objective To research the expression of Caspase-3 in perifocal tissue of intracerebral hemorrhage (ICH) and investigate the association between Caspase-3 and neuron apoptosis in perifocal tissue of ICH. Methods Sixty wistar rats were randomly divided into ICH group (n = 30) and sham operated group (n = 30). ICH rat models were prepared with injection of autologous blood into the right caudate nucleus. Each group was randomly divided into 5 various stages: 6 h， 12 h， 24 h， 48 h and 96 h. The expression of Caspase-3 was measured with immunohistochemistry method. Apoptosis was characterized by terminal deoxynucleotide transferase mediated uridine 5-triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL) staining. Results Protein expression of Caspase-3 and neuron apoptosis of ICH group was higher than sham operated group (P ＜ 0.01). The association between Caspase-3 and neuron apoptosis in perifocal tissue of ICH was positively relative (P ＜ 0.05). Conclusion Caspase-3 and apoptosis are involved in pathophysiologic process of ICH.

[Key words] Intracerebral hemorrhage; Caspase-3; Neuron apoptosis

凋亡與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育、再生、增殖、病理變性密切相關(guān)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，在死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和線粒體通路等多條細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮著重要的作用，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必需物質(zhì)[1]。本研究利用自體血注射造大鼠腦出血模型，采用免疫組織化學(xué)染色和TUNEL法來研究Caspase-3在血腫周圍的表達(dá)及其與血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取60只成年Wistar大鼠，體重（240±20）g，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。將實驗動物按隨機化的原則分為假手術(shù)組和出血組各30只。每組分為6、12、24、48、96 h 5個亞組。每個亞組6只。

1.2 主要試劑

TUNEL試劑盒（Sigma公司），兔抗Caspase-3多克隆抗體、SP系列二抗、DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 大鼠尾狀核腦出血模型的建立

參照Xue M等[2]的方法，大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，頭頂正中縱行切口，鈍性分離暴露前囟，在前囟前0.2 mm、中線向左旁3.5 mm處，用牙科鉆頭鉆一直徑為1.0 mm的小孔，微量注射器由該孔垂直刺入5.0 mm，至尾狀核位置，出血組大鼠被注入自體股動脈血50 μL，假手術(shù)組注入0.9%氯化鈉注射液50 μL，縫合消毒皮膚。

1.4 標(biāo)本及病理切片的制作

各組大鼠在相應(yīng)的時間點用水合氯醛（600 mg/kg）深度麻醉，剖開胸腔，從左心室輸注0.9%氯化鈉注射液約300 mL，4%福爾馬林液150 mL，斷頭取腦，標(biāo)本浸于4%福爾馬林液中固定24 h，以針眼為中心取厚約1 cm的冠狀切片，石蠟包埋、切片，片厚2 μm，進行Caspase-3免疫組化和TUNEL染色。

1.5 圖像采集分析

光鏡下，Caspase-3陽性神經(jīng)細(xì)胞呈棕黃色或褐色，在400倍視野下，每張切片選取6個視野，利用Leica顯微照像系統(tǒng)和BDIS圖像分析軟件，計算Caspase-3陽性細(xì)胞的平均積分光密度值。凋亡指數(shù)計算：凋亡神經(jīng)細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞核內(nèi)可見黃色或棕褐色顆粒。在400倍視野下隨機計數(shù)血腫周圍4個視野內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞及凋亡陽性細(xì)胞，凋亡指數(shù)=凋亡陽性細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組同一時間點均數(shù)間的比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，Caspase-3與TUNEL的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦血腫周圍Caspase-3的表達(dá)

假手術(shù)組尾狀核組織可見Caspase-3表達(dá)，表達(dá)水平很低，各時點表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。出血組腦血腫周圍組織Caspase-3有較強的表達(dá)，6 h表達(dá)開始升高，24 h Caspase-3表達(dá)水平達(dá)到峰值，96 h仍有表達(dá)，多組間陽性細(xì)胞的平均積分光密度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）；出血組與假手術(shù)組同一時間點Caspase-3的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。見表1。

2.2 原位末端標(biāo)記法染色

光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)集聚于細(xì)胞核內(nèi)，靠近核膜，假手術(shù)組僅見極少量凋亡神經(jīng)細(xì)胞。出血組凋亡神經(jīng)細(xì)胞主要分布于血腫周邊，6 h凋亡細(xì)胞即增多，48 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡達(dá)峰值，96 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，多亞組間凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。出血組與假手術(shù)組之間同一時間點凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。見表2。

2.3 血腫周圍細(xì)胞凋亡與Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

凋亡指數(shù)與前一時間點Caspase-3的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.956，P ＜ 0.05）。見表3。

3 討論

正常細(xì)胞中Caspase-3以酶原Procaspase-3形式存在，在多種蛋白水解酶的催化作用下，Procaspase-3發(fā)生裂解而活化[3]。本研究顯示：出血組Caspase-3的表達(dá)主要分布于腦血腫周圍，表達(dá)從6 h開始逐漸增高，24 h達(dá)峰，4 d時表達(dá)明顯減少，24 h與12 h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。同時點出血組與假手術(shù)組Caspase-3的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。此結(jié)果與吳家冪等[4]的研究結(jié)果相似，提示腦出血激發(fā)了血腫周圍腦組織Caspase-3的表達(dá)。

血腫周圍腦組織Caspase-3的表達(dá)的機制可能有以下方面：①已有研究證實腦血腫周圍Fas（自殺相關(guān)因子）高表達(dá)[5]，F(xiàn)as在胞內(nèi)與Fas死亡結(jié)構(gòu)域鏈接蛋白（FADD）和Procaspase-8共同組成死亡信號復(fù)合體（DISC）使Procaspase-8發(fā)生自身催化，Caspase-8隨后激活Caspase-3；②腦出血后產(chǎn)生自由基、乳酸中毒和Ca2+內(nèi)流增加導(dǎo)致線粒體內(nèi)大量細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞漿，在三磷酸腺苷存在的條件下細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1結(jié)合，再結(jié)合Caspase-9前體并激活Caspase-9，進而激活Caspase-3；③Caspase-3酶原也能聚集和自我活化[6]。

本研究顯示出血組凋亡細(xì)胞主要分布于血腫周邊區(qū)，遠(yuǎn)離血腫的腦組織凋亡細(xì)胞逐漸減少。6 h開始逐漸增高，48 h達(dá)峰，96 h凋亡細(xì)胞有所減少，但仍維持在較高水平，各時間點凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。本研究顯示，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞與Caspase-3的表達(dá)在空間上具有一致性，主要分布于血腫周邊區(qū)的腦組織，提示Caspase-3參與了腦出血血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡主要涉及了Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑，活化的Fas通過形成死亡信號復(fù)合體，活化Caspase-3，繼而裂解ICAD而釋放CAD，CAD降解胞核內(nèi)的染色體DNA[7]，致使血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡。另外Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑中活化的Caspase-8也可啟動細(xì)胞凋亡的線粒體路徑，活化Caspase-3，進而致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。腦出血后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞鈣內(nèi)流超載，細(xì)胞內(nèi)外鈣離子失衡，啟動細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)路徑，活化Caspase-12，進而活化Caspase-3，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8]。因此腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是通過Fas介導(dǎo)的死亡受體路徑、線粒體路徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)路徑共同完成的，這三個路徑的交聯(lián)點為Caspase-3，印證了Caspase-3為細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶的觀點。

qCaspase-3的高表達(dá)時間早于細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)，細(xì)胞凋亡過程可能是抑凋亡基因、促凋亡基因、細(xì)胞因子間相互作用，此復(fù)雜過程需要能量，需要合成核糖核酸、蛋白質(zhì)等，所以，從凋亡的啟動到典型的凋亡形態(tài)的出現(xiàn)需數(shù)小時或數(shù)天不等。以上結(jié)果表明血腫周圍神經(jīng)凋亡與Caspase-3的表達(dá)具有相關(guān)性，Caspase-3、凋亡參與了大鼠腦血腫周圍腦組織損傷的病理生理過程。

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（收稿日期：2011-11-24）