一氧化氮合酶基因多態(tài)性與吉林省漢族人群冠心病的關(guān)系研究

[摘要] 目的 研究內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。 方法 收集120例患有冠心病的患者和102例年齡、性別相匹配的健康對(duì)照者， 采用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)性分析其多態(tài)性并確定基因型。 結(jié)果 冠心病組eNOS基因的（TT+TG）基因型明顯的高于正常對(duì)照組（OR = 2.02，95％CI：1.09-3.75，P < 0.05），兩組等位基因T差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR = 1.96，95%CI：1.14~3.36，P < 0.05）。 結(jié)論 eNOS基因G894T基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 冠心病；動(dòng)脈粥樣硬化； 基因多態(tài)性；eNOS

[中圖分類號(hào)] R541.402 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）03-0087-02

Association study between the polymorphisms of nitric oxide synthase gene and coronary heart desease in Jilin Province

YU Wei

The People's Hospital of Changchun City in Jilin Province， Jilin 130051，China

[Abstract] Objective To investigate the risk of coronary heart desease with endothelial constitutive nitric oxide synthase gene polymorphisms. Methods We investigated the G894T mutations in the eNOS gene in 120 Chinese patients with coronary heart desease and 102 age- and sex-matched healthy controls. Its genotype was defined by the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. Results The (TT+TG) genotype of eNOS in the coronary heart desease group were higher than control group（OR = 2.02， 95％CI: 1.09-3.75， P < 0.05）.The allele gene T had statistical meaning in two group(OR=1.96， 95％ CI: 1.14-3.36， P < 0.05）. Conclusion There is a synergistic effect of eNOS gene polymorphisms in patients with coronary heart desease.

[Key words] Coronary heart desease; Atherosclerosis; Polymorphism; eNOS

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（CAD）已成為許多中老年人死亡的一個(gè)最常見原因，并且與遺傳因素密切相關(guān)。故應(yīng)用分子生物學(xué)方法來研究基因致病已逐步成為熱點(diǎn)。NO具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板聚集和白細(xì)胞粘附、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血壓的作用[1]。決定NO合成的關(guān)鍵酶是一氧化氮合酶（NOS），內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（eNOS）的基因多態(tài)性已被證實(shí)，并且與NO生成量的降低有關(guān)[2]。我們研究吉林漢族人群冠心病的eNOS基因多態(tài)性，用以探討eNOS基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2009年1月~2010年6月于我院心內(nèi)科確診的冠心病患者120例，年齡（62.93±10.14）歲；同時(shí)選擇年齡和性別相匹配的健康體檢者102作對(duì)照，年齡（63.69±11.13）歲。病例組均符合1979年WHO制定的關(guān)于缺血性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照者均無心腦血管病史。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成與設(shè)計(jì) 采用Lv等[3]針對(duì)eNOS基因G894T多態(tài)性設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，由上海生工生物工程公司合成。上游引物：5’-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3’；下游引物：5’-CCC AGT CAA TCC TTT GGT GCT CA-3’。

1.2.2 基因組DNA提取 抽取冠心病患者及正常對(duì)照者空腹?fàn)顟B(tài)下的全血5mL加EDTA抗凝，采用鹽析法來提取基因組DNA，保存于-20℃冰箱。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增體系 ①PCR反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4 min. ②PCR擴(kuò)增體系：10X PCR緩沖液2 μL，5 μmol/L上下游引物混合液3 μL ，TaqDNA聚合酶0.25 μ/uL，2 mol/L dNTP 2 uL，待測模板DNA l μL，補(bǔ)水至20 μL。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切 總反應(yīng)體系為20 μL，其中10X緩沖液2 μL，PCR產(chǎn)物l0 μL， 內(nèi)切酶BanII 6 u，其余用無菌水補(bǔ)充，在37℃條件下水浴16 h 。酶切產(chǎn)物用EB染色，3％瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.5 血脂和血糖測定 所有測定結(jié)果均來自于我院。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 11.5。等位基因頻率用基因計(jì)數(shù)法，組間基因型與等位基因頻率比較用χ2 檢驗(yàn)，用比值比（OR）及95％可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。計(jì)量資料用（x±s）表示，各組間數(shù)據(jù)的比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 冠心病組與對(duì)照組臨床特征比較

冠心病組的血壓、血脂、血糖以及吸煙者比例與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），平均年齡和性別構(gòu)成無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 eNOS基因型分析

根據(jù)限制性內(nèi)切酶BanII酶切的情況，eNOS G894T基因型有三種，即完全酶切的GG型（320bp、137bp 2條帶）；部分酶切的TG型（457 bp、320bp、137 bp 3條帶）和完全不被酶切的TT型（457 bp 1條帶），見圖1。

2.3 冠心病組與對(duì)照組eNOS基因多態(tài)性的比較

冠心病組的TT+TG基因型顯著高于對(duì)照組（OR =2.02，95％CI：1.09~3.75；P < 0.05）。eNOS G894T基因型在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組的T等位基因頻率亦顯著高于對(duì)照組（OR = 1.96，95％ CI：1.14~3.36；P<0.05）。見表2。

3 討論

NO是由L-精氨酸和分子氧在NOS催化下生成的，具有顯著的血管擴(kuò)張作用。另外，它還能抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附，并且能夠阻止平滑肌細(xì)胞的遷移和增生，從而阻止血管動(dòng)脈硬化[4]。冠心病的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化。NO 生成和釋放減少，則可導(dǎo)致血小板等有形成分大量黏附聚集形成血栓，平滑肌細(xì)胞大量增生和遷移，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化。eNOS基因G894T多態(tài)性已被證實(shí)，即在第7外顯子處的第894位G被T替代，導(dǎo)致密碼子298處谷氨酸（Glu）被天門冬氨酸（Asp）替代[5]。Lembo研究亦發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊的形成是由于Asp298的純合子在eNOS基因上的錯(cuò)義表達(dá)所致[6]。eNOS基因第7外顯子第894位G被T替代，密碼子298位上的谷氨酸即由天門冬氨酸替代，產(chǎn)生了eNOS基因的錯(cuò)義表達(dá)，于是導(dǎo)致NO合成減少，從而引起頸動(dòng)脈粥樣斑塊形成。eNOS基因G894T多態(tài)性是頸動(dòng)脈斑塊的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。因此，冠心病的發(fā)生、發(fā)展可能與eNOS 變異有關(guān)。

本研究顯示，吉林省漢族人群中冠心病組的TT+TG基因型顯著高于對(duì)照組（OR = 2.02，95％CI:1.09~3.75；P < 0.05)。eNOS G894T基因型在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組的T等位基因頻率亦顯著高于對(duì)照組（OR = 1.96，95％ CI：1.14~3.36；P < 0.05）。提示T等位基因可能是冠心病的遺傳易感基因。更進(jìn)一步證實(shí)中國人的eNOS基因多態(tài)性與冠心病有相關(guān)性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Niwa M ，Inao S，Takayasu M ，el a1． Time course of expression of three nitric oxide syntbase soforms after transient middle cerebra1artery occlusion in rats[J]． Neurol Med Chir （Tokyo），2001，41（2）：63-72．

[2] Tsukada T，Yokoyama K，Arai T， et a1. Evidence of association of the ecNOS gene poly morphism with plasma NO metabolite levels in humans[J]．Biochem Biophys Res Commun， 1998， 245（1）：190-193.

[3] 呂浩，雷霆，趙琳，等． 腦梗死與一氧化氮合酶基因多態(tài)性的關(guān)系[J]． 中國臨床康復(fù)，2004，8（22）：4469-4471.

[4] Macleod MJ，Dahiyat MT，Cumming A． No association between Glu/Asp polymorphism of NOS3 gene and ischemic stroke[J]． Neurology， 1999，53 （2）：418-420.

[5] Shimasaki Y，Yasue H，Yoshimura M，et al. Association of the missense Glu298Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene with myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardial，1998，31（7）：1506-1516.

[6] Lembo G， De Luca N， Battagli C，et al． A common vLriant of endothelial nitric oxide Synthase （Glu298Asp） is an independent risk factor for carotid atherosclerosis[J]. Stoke，200l，32（3）：735-740.

（收稿日期：2011-11-21）