δ阿片受體激動劑DADLE對膿毒癥大鼠肝組織高遷移率族蛋白1水平的影響

[摘要] 目的 研究δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）對膿毒癥大鼠肝組織高遷移率族蛋白1（HMGB1）水平的影響。 方法 將96只Sprague-Dawley（SD）大鼠分為假手術組（SO）、膿毒癥組（SEP）、DADLE組[制模后立即給藥DADLE（5mg/kg，腹腔內注）]， 每組32只。采用改良盲腸結扎穿孔方法(CLP)建立大鼠膿毒癥模型，于制模后6 h，12 h，18 h，24 h每組各取8只處死取材， Western Blot法檢測肝組織HMGB1水平。 結果 12 h 時SEP組和DADLE組HMGB1水平與SO組相比均明顯升高（P < 0.05)，且DADLE組明顯低于SEP組（P < 0.05)；18 h時SEP組和DADLE組HMGB1水平達到最高。同樣DADLE組明顯低于SEP組（P < 0.05)；24 h時SEP組和DADLE組HMGB1水平較18 h有所降低，但DADLE組仍明顯低于SEP組（P < 0.05)。 結論 DADLE能明顯降低膿毒癥大鼠肝組織HMGB1水平。

[關鍵詞] DADLE；膿毒癥；高遷移率族蛋白1

[中圖分類號] R826.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）03-0007-02

Effect of delta-opioid receptor agonist DADLE on liver tissue HMGB1 level in rat with sepsis

TAO Yulong TANG Chengwu FENG Wenming BAO Ying ZHU Ming

Department of Hepatobiliary Surgery and Molecular Surgery，the Huzhou Ctiy First People’s Hospital，Zhejiang Province，Huzhou 313000，China

[Abstract] Objective To study the effect of delta-opioid receptor agonist (DADLE) on liver tissue HMGB1 level in rat with sepsis. Methods All of 96 SD rats were randomly divided in to sham operated group (SO)， septic group (SEP)， and DADLE group(DADLE). Septic model was produced by cecal ligation and puncture (CLP). In SO group， the abdomen was opened without any other treatment. In DADLE group， DADLE was administered at a dose of 5 mL/kg by intra-peritoneal injection after CLP. Rats were sacrificed at 6 h， 12 h， 18 h and 24 h after CLP. Liver tissue HMGB1 level was determined by Western Blot. Results Liver tissue HMGB1 levels of SEP and DADLE group began to increase at 12 h， and reached the peak around 18 h after CLP. Notably， liver tissue HMGB1 levels of DADLE group at 12 h， 18 h and 24 h were significantly lowered than those of SEP group (P < 0.05). Conclusion DADLE can significantly decrease liver tissue HMGB1 level of septic rat.

[Key words] DADLE; Sepsis; High-mobility Group box 1 Protein

膿毒癥是嚴重感染、創傷及大手術等應激狀況時常見的并發癥，已經成為當今重癥監護室的首要死亡原因[1]。膿毒癥時多種炎癥因子參與了膿毒癥的病理過程，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box1 protein，HMGBl）作為潛在晚期炎性因子，是膿毒癥致死效應的重要炎性介質，是致急性肝損傷（ALI）的一種重要的細胞因子[2]，干預HMGB1可有效防止MODS的發生與發展[3-4]。δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）是一種人工合成的非選擇性δ阿片受體激動劑，我們以往的研究發現DADLE能明顯減輕膿毒癥大鼠肝組織損傷[5]，本研究旨在探討其對膿毒癥大鼠肝組織HMGBl水平的影響，從而對DADLE在膿毒癥中對肝組織的保護作用進行初步闡述。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）分子式C29H39N507，購自美國Sigma公司。

1.2 動物分組及膿毒癥模型建立

清潔級健康SD雄性大鼠96只，體重270～320 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，隨機分為DADLE組、假手術組（SO組）和膿毒癥組（SEP組），每組32只，參照Wichterman等[6]的改良的盲腸結扎穿孔（CLP）方法建立大鼠膿毒癥模型，假手術組除不施行CLP，其余操作同SEP組，DADLE組在模型建立后立即腹腔注射濃度為0.5 mg/mL的DADLE（劑量：5mL/kg體重）。CLP后6 h、12 h、18 h、24 h每組斷頸處死8只大鼠。

1.3 肝組織HMGBl蛋白水平檢測

將肝組織蛋白轉印至硝酸纖維素膜后在封閉液中與一抗（兔抗HMGBl多克隆抗體，購自美國BD Pharmingen公司）結合，然后與二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，購自北京中山生物技術有限公司)室溫孵育。采用化學發光反應試劑盒進行發光，暗室曝光后底片經圖像分析系統（LEICA Q-5501W，德國Leiea公司）處理，根據各條帶的吸光度值進行定量分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS10.0軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

DADLE對膿毒癥大鼠肝組織HMGB1水平的影響見表1。CLP后6 h SEP和DADLE組肝組織HMGB1水平開始升高，但三組間無統計學意義（P > 0.05）；12 h 時SEP組和DADLE組HMGB1水平與SO組相比均明顯升高（P < 0.05)，且DADLE組明顯低于SEP組（P < 0.05)；18 h時SEP組和DADLE組HMGB1水平達到最高。同樣DADLE組明顯低于SEP組（P < 0.05)；24 h時SEP組和DADLE組HMGB1水平較18 h有所降低，但DADLE組仍明顯低于SEP組（P < 0.05）。

3 討論

本研究采用的大鼠CLP 模型與臨床相關性較強的膿毒癥模型，血中內毒素水平、細胞因子升高幅度，內毒素檢出率及細菌培養(包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)陽性率高、單純的抗炎治療在此模型失敗都與臨床相似[7]。

膿毒癥時細菌產生內毒素導致大量炎癥因子釋放，包括早期炎癥因子（如TNF-α 和IL-1β）和晚期炎癥因子（如HMGB1）。正是這些炎癥因子，導致組織器官的損傷[8， 9]。然而，一些針對早期炎癥因子的治療在臨床上并未收到良好的療效，因為早期炎癥因子在炎癥發展的早期階段就已經開始釋放，并未給拮抗治療留下足夠的時間窗。況且，在全身炎癥反應啟動之后再使用 TNF-α和IL-1β的抑制劑也無法取得明顯的療效[10]。有學者發現，使用抗HMGB1抗體能明顯減少膿毒癥小鼠的死亡率，即使是在膿毒癥發生24 h之后仍有明顯的保護作用[11]，這意味著針對HMGB1的治療策略具有良好的時間窗，我們以往的研究也發現，DADLE在CLP后4 h給藥仍能對膿毒癥大鼠起到保護作用，其機制可能與抑制晚期炎癥因子HMGB1表達有關[12]，因此，HMGB1可能是治療膿毒癥的新靶點。本研究中DADLE組肝組織HMGB1水平在12 h，18 h和24 h均明顯低于SEP組，表明DADLE能明顯抑制肝組織HMGB1的表達，減輕急性肝損傷，從而對膿毒癥大鼠肝損傷起到一定的保護作用。

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（收稿日期：2011-08-01）