淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表達和免疫原性鑒定

[摘要] 目的 克隆并構建淋病奈瑟菌表面蛋白A（nspA）基因原核表達系統，并對重組產物rNspA進行免疫原性鑒定。 方法 采用PCR擴增nspA基因，構建nspA基因原核表達系統。SDS-PAGE檢測目的重組蛋白rNspA表達情況，Ni-NTA親和層析法提純rNspA，免疫雙擴散試驗及Western Blot鑒定rNspA的免疫原性。 結果 克隆的nspA基因與GenBank中相關序列相似性為100%，rNspA表達量為細菌總蛋白的40.1%，提純的rNspA在SDS-PAGE后顯示為單一的蛋白條帶。rNspA抗血清免疫雙擴散效價為1∶4，rNspA抗血清能有效識別rNspA。 結論 所構建的nspA基因原核表達系統能高效表達rNspA，表達的產物有良好的免疫原性，為淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基礎。

[關鍵詞] 淋病奈瑟菌；nspA基因；克隆／重組表達；免疫原性鑒定

[中圖分類號] R759.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）03-0009-02

Construction and prokaryotic expression of Neisseria gonorrhoeae nspA gene and immunological identification of the expressed product

DU Peng WU Senlin ZHONG Yawen SUN Aihua

Zhejiang Medical College， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To clone nspA gene of N.gonorrhoeae and then construct its prokaryotic expression system， and to identify the immunogenicity of its product. Methods nspA gene was amplified by PCR and its prokaryotic expression system was then constructed. SDS-PAGE was used to measure the expression of target recombinant protein rNspA， Ni-NTA affinity chromatography was applied to extract rNspA. Double immunodiffusion and Western Blot assay were applied to indentify immunogenicity of rNspA. Results Sequence similarity of the cloned nspA gene was 100% compared to the corresponding sequence in GenBank. The expression output of rNspA was approximately 40.1% of the total bacterial proteins. The extracted rNspA showed a single protein band in gel after SDS-PAGE. The immunodiffusion titer of rabbit antiserum against rNspA was 1∶4. The rNspA antiserum was able to recognize rNspA. Conclusion The constructed prokaryotic expression system enable express rNspA with high efficiency， and can be used as a candidate antigen for developing genetic engineering vaccine.

[Key words] Neisseria gonorrhoeae; NspA Gene; Clone/recombinant expression; Immunogenicity/identification

淋病奈瑟菌感染引起的淋病發病率目前居于我國各類性傳播疾病首位[1]。淋病奈瑟菌感染后可產生特異性免疫力，但維持時間短導致重復感染。研究認為淋病奈瑟菌免疫逃逸機制可能與該菌外膜蛋白抗原多態性相關[2]。

1999年Plante等研究發現淋病奈瑟菌表面蛋白A（Neisseria gonorrhoeae surface protein A，NspA）氨基酸序列淋病奈瑟菌之間同源性高達98%[3]。Plante等用放射性標記的NspA抗體檢測NspA在細胞膜表面的暴露情況表明淋球菌NspA位于完整的細菌表面[3]，可見NspA能在菌體表面持續表達，抗原高度保守并具有較強免疫原性，是一個很好的淋球菌疫苗候選者。本研究選擇淋病奈瑟菌表面蛋白A作為研究對象，通過克隆nspA基因、重組表達rNspA蛋白、采用Ni-NTA親和層析技術提純重組蛋白rNspA，以期為后繼淋病奈瑟菌疫苗研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體

淋病奈瑟菌標準株WHO-A、表達宿主菌E.coli BL21DE3和原核表達載體pET42均由浙江大學醫學院病原生物系提供。PCR試劑盒和pMD18-T由TaKaRa公司提供。DNA小量快速純化試劑盒由BioColor公司生產。

1.2 目的基因nspA的提取及擴增

新鮮細菌培養物經PBS洗滌后離心取沉淀，用基因組提純試劑盒（BioColor）提取DNA。參考淋病奈瑟菌標準株WHO-A（GenBank：AY157539.1）nspA基因序列設計用于擴增nspA基因全長的上下游引物，結合內切酶圖譜設置酶切位點。上游引物序列：5’-CGC GGA TTC （BamH I）ATG AAA AAA GCA CTT GCC GCA-3’，下游5’-CGC AAG CTT（Hind Ⅲ）CTA TCA GAA TTT GAC GCG CAC GCC-3’，引物委托上海invitrogen生物技術有限公司合成。PCR總體積為100 μL，內含各dNTP 2.5 mmol/L、上下游引物各250 nmol/L、Taq酶2.5 U、淋病奈瑟菌基因組DNA模板100 ng、1×PCR緩沖液（pH8.3）。PCR參數：94℃ 5 min；94℃ 變性30 s、54℃ 退火30 s、72℃ 延伸60 s，30個循環；72℃ 10 min。擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 T-A克隆和核苷酸序列測定

用DNA小量快速純化試劑盒提純上述nspA基因PCR產物，將目的擴增片段克隆至pMD18-T中形成重組質粒pMD18-TnspA，轉化入E.coli DH 5α株并經氨芐抗性和藍白斑雙重篩選，堿變性法提取質粒，雙酶切初步鑒定后測序。

1.4 nspA基因原核表達系統的構建

采用小量堿變性法提取測序結果有正確插入序列的重組質粒pMD18-TnspA，BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質粒pMD18-TnspA，獲得的目的基因片段，按5∶1比例將獲得的目的基因片段nspA和線性化的表達載體pET42a混合，用T4連接酶連接，連接產物轉化于表達宿主菌E.coli BL21中形成目的基因表達系統E.coli BL21pET42a-nspA，提取重組質粒雙酶切后再次測序。

1.5 目的重組蛋白rNspA的表達和純化

測序結果正確的E.coli BL21pET42a-nspA在含50 μg/mL卡那抗性的LB培養液中37℃振蕩培養4 h后，加入誘導劑IPTG使終濃度為1.0 mmol/L，37℃繼續振蕩培養4 h。采用SDS-PAGE聯合Bio-Rad凝膠圖像分析系統測定rNspA表達量，采用Ni-NTA親和層析法提純表達的目的蛋白rNspA，紫外線分光光度法測定蛋白濃度。

1.6 重組蛋白rNspA免疫原性分析

將2 mg rNspA與弗氏佐劑混合，每次間隔1周皮內多點免疫家兔3次，末次免疫后10 d心臟采血后分離血清，采用免疫擴散試驗檢測其效價。Western Blot檢測rNspA的免疫原，10%SDS-PAGE鑒定重組蛋白rNspA并電轉至PVDF膜，rNsp的兔抗血清1︰500稀釋后為一抗，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（Jackson Immuno Research）1∶3000稀釋后為二抗。

2 結果

2.1 nspA基因擴增、克隆和測序結果

PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，525 bp處有nspA基因擴增片段。T-A克隆重組質粒pMD18-TnspA和亞克隆重組質粒pET42anspA經BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后可獲得預期的酶切圖譜（圖1）。克隆和亞克隆重組質粒測序結果nspA基因核苷酸和氨基酸序列與GenBank中登錄的相應序列（AY157539.1）完全相同。

2.2 rNspA的表達和提純效果

SDS-PAGE結果顯示，目的重組融合蛋白rNspA表達量最高，可達細菌總蛋白的40.1%，Ni-NTA親和層析法提純后rNspA顯示為單一的蛋白條帶（圖2）。

2.3 目的重組蛋白免疫原性檢測結果

rNspA兔抗血清免疫雙擴效價為1∶4。Western blot結果表明，rNspA兔抗血清能有效識別rNspA并與之結合（圖2）。

3 討論

人類是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通過性接觸傳播，淋病奈瑟菌引起的淋病是我國最常見性病之一。淋病奈瑟菌侵襲患者泌尿生殖系統，感染后出現尿道炎和宮頸炎以及附睪炎、盆腔炎等并發癥，女性患者還可由于并發癥造成不育、宮外孕等嚴重后果[4-6]。解放前我國淋病流行十分嚴重，經綜合治理到二十世紀六十年代中期，淋病在我國已基本消滅，但八十年代后隨著改革開放淋病又重新傳入我國，到了二十世紀末，淋病發病率位居我國性病之首，隨著抗生素廣泛應用，2000年后淋病的發病率雖有下降，但總體數量仍然龐大，淋病感染不容忽視[5，6]。根據中國疾病預防控制中心公布的甲、乙類傳染病統計數據，2009年和2010年我國淋病患者數分別為105 544人和119 824人。且由于臨床藥物使用混亂、劑量不足、療程不規范及部分患者在無任何指征情況下自行隨意用藥等，導致淋病奈瑟菌的耐藥性日趨增強，給淋病治療帶來了困難[4]。淋病發病率高和淋病奈瑟菌耐藥性強是擺在世界各國衛生部門亟待解決的難題。各國都在尋找淋病新的治療和預防方法，疫苗成為研究的熱點。目前研究較多的候選疫苗，如Por、Pil、Opa、Los等[3]。但研究發現上述候選疫苗的抗原都存在不同程度的變異容易產生免疫逃逸。文獻報道淋病奈瑟菌nspA基因編碼的NspA氨基酸序列同源性高達98%，與腦膜炎奈瑟菌的同源性也達93%，說明該序列非常保守，是一個很好的疫苗候選者[3]。

我們根據GenBank公布的淋病奈瑟菌WHO-A株nspA基因序列設計引物并進行克隆、表達，構建的原核表達系統E.coli BL21pET42a-nspA在37℃ 1.0 mmol/L的IPTG誘導下重組蛋白rNspA表達量可達細菌總蛋白量40.1%，即使在較低濃度的誘導劑（0.1 mmol/L的IPTG）作用下rNspA的量可達細菌總蛋白量的35%以上，并且主要以包涵體形式存在，這有利于產業化。Western bolt結果證實，rNspA兔抗血清與rNspA結合能有效識別，說明rNspA具有被抗體識別的抗原決定簇，具有良好的免疫反應性。免疫雙擴效價為1∶4，說明rNspA免疫家兔后能產生高效價抗體，具有良好的抗原性。

綜上所述，我們已成功建立了rNspA高效表達系統，所表達的rNspA有良好的免疫原性，可作為基因工程疫苗的候選抗原。

[參考文獻]

[1] Sun AH， Fan XL， Gu Y， et al. Predominant porB1A and porb1B genotypes and correlateion of gene mutations with drug resistance in Neisseria gonorrhoeae isolates in Eastern China[J]. BMC Infectious Diseases，2010，10（10）：323-310.

[2] Plant LJ，Jonsson AB. Type IV pili of Neisseria gonorrhoeae influence the activation of human CD4+ T cells[J]. Infect Immun，2006，74（1）：442-448.

[3] Plante M，Cadieux N，Rioux CR，et al. Antigenic and molecular conservation of the gonococcal NspA protein[J]. Infect Immun，1999，67（6）：2855-2861.

[4] Workowski KA，Berman SM. Sexually transmitted diseases treatment guidelines[J]. MMWR Recomm Rep，2006，55（RR11）：1-94.

[5] Tazi1 L，Losada MP，Gu WM，et al. Population dynamics of Neisseria gonorrhoeae in Shanghai，China：a comparative study[J]. BMC Infectious Diseases，2010，10（13）：1-8.

[6] Su X，Jing F，Qimuge D，et al. Surveillance of antimicrobial susceptibilities in Neisseria gonorrhoeae in Nanjing，China，1999-2006[J]. Sex Transm Dis，2007，34（12）：995-999.

（收稿日期：2011-11-08）