重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9及水通道蛋白-4表達(dá)的影響

[摘要] 目的 探討重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）對(duì)大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法 健康雄性SD大鼠55只隨機(jī)分為假手術(shù)組（n = 5）、對(duì)照組（n = 25）和EPO治療組（n = 25）；對(duì)照組和治療組采用改進(jìn)的Feeney等的方法制作腦創(chuàng)傷模型，EPO治療組在模型建立后立即腹腔注射rhEPO 5000 U/kg，對(duì)照組和假手術(shù)組在等時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水。根據(jù)傷后處死時(shí)間點(diǎn)不同每組再分為5個(gè)亞組，即6 h、24 h、48 h、3 d、7 d組，每個(gè)亞組5只動(dòng)物。斷頭、取腦，行HE染色和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大腦皮層組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及水通道蛋白-4（AQP-4）的表達(dá)。 結(jié)果 腦創(chuàng)傷大鼠6 h創(chuàng)傷灶腦組織出現(xiàn)MMP-9和AQP-4的表達(dá)。與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。EPO治療組和對(duì)照組相比較MMP-9及AQP-4的表達(dá)明顯降低（P < 0.05）。 結(jié)論 rhEPO對(duì)大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)降低MMP-9及AQP-4的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 急性創(chuàng)傷性腦損傷；促紅細(xì)胞生成素；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；水通道蛋白-4

[中圖分類號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）03-0004-03

Effects of rhEPO on expression of MMP-9 and AQP-4 in brain tissues of rats with acute traumatic brain injury

ZHOU Peng1△ HAO Jiehe2▲

1.Department of Postgraduates， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China；2.Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030000， China

[Abstract] Objective To explore the neuroprotective mechanisms of recombinant humam erythropoietin (rhEPO) on the rats after acute traumatic brain injury. Methods Fifty-five healthy adult male SD rats were randomly dividied into sham operation group (n = 5)， control group (n = 25) and the EPO treatment group (n = 25). The traumatic brain injury of the latter two groups was induced by Feeney's. rhEPO treatment group underwent intraperitoneal injection of 5000 U/kg rhEPO after the injury. The rats in the control group and the EPO treatment group were redivided into 5 subgroups (6 h、24 h、48 h、3 d、7 d groups) of 5 rats each respectively according to different time after the injury. The histology was detected by HE staining， the expression of MMP-9 and AQP4 was detected by immunohistochemical. Results The expression of MMP-9 and AQP-4 in the brain tissue of the injury appeared 6 hours after trauma and was significantly higher in the injury group than that in the sham operation group (P < 0.05). The expression was significantly lower in rhEPO treatment group than that in control group (P < 0.05). Conclusion Recombinant human EPO may be neuroprotective against acute traumatic brain injury in rats， probably by inhibiting the activities of MMP-9 and AQP-4.

[Key words] Acute traumatic brain injury; Erythropoietin; Matrix metalloproteinase-9; Aquaporin-4

急性創(chuàng)傷性腦損傷是神經(jīng)外科最常見(jiàn)疾病之一，致死、致殘率高，嚴(yán)重威脅著人類生存及生活質(zhì)量。創(chuàng)傷后的血腦屏障完整性的破壞是顱腦創(chuàng)傷后的主要病理改變，是導(dǎo)致血管源性腦水腫、炎性反應(yīng)等各種繼發(fā)性病理改變的病理基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)和腦水腫在創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是影響腦創(chuàng)傷發(fā)展和預(yù)后的兩個(gè)重要因素。MMP-9是最重要的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）降解酶之一，其作用使細(xì)胞外基質(zhì)降解的正常平衡被破壞，參與血腦屏障破壞、炎性反應(yīng)、腦水腫形成和髓鞘脫失等病理過(guò)程[1]。AQP-4是腦內(nèi)最主要的水通道蛋白，起著調(diào)節(jié)腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要功能，與腦水腫的形成密切相關(guān)[2]。最近研究證明EPO在抗炎癥反應(yīng)、減輕腦水腫、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、改善神經(jīng)功能方面具有積極的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)研究EPO對(duì)AQP-4和MMP-9在大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷表達(dá)的影響來(lái)進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)急性創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）注射液購(gòu)于北京四環(huán)生物制藥有限公司。AQP-4、MMP-9兔抗鼠多克隆抗體和二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠55只（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量約250～300 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組（n = 5）、對(duì)照組（n = 25）和EPO治療組（n = 25）；對(duì)照組和EPO治療組又按處死時(shí)間點(diǎn)不同即傷后6 h、24 h、48 h、3 d和7 d分為五個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。

1.2 實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)方法

1.2.1 腦創(chuàng)傷模型制作 采用改進(jìn)Feeney法自由落體硬膜外撞擊方法造致傷模型。大鼠稱重后，10%水合氯醛（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，頭部固定于立體定向儀上，無(wú)菌條件下暴露右頂骨，于矢狀縫中線旁開(kāi)2.5 mm、冠狀縫后1.5 mm處，牙科臺(tái)式電鉆鉆孔擴(kuò)大成直徑5.0 mm的類圓形骨窗，保持硬腦膜完整，放置撞擊圓錐，將40 g砝碼置于15 cm高處呈自由落體撞擊，造成局灶性中度腦挫裂傷，切口處消毒，縫合頭皮。假手術(shù)組僅切開(kāi)頭皮，開(kāi)骨窗，不造成腦損傷。動(dòng)物模型制作成功后，EPO治療組立即腹腔注射人重組EPO 5000 U/kg，假手術(shù)組和對(duì)照組均腹腔注射等量的生理鹽水。術(shù)畢各組動(dòng)物頭部消毒后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常喂食水。

1.2.2 神經(jīng)行為評(píng)定 大鼠顱腦損傷后行神經(jīng)功能評(píng)分（neurological severity score，NSS）[4]。運(yùn)動(dòng)測(cè)試6分，感覺(jué)測(cè)試2分，直杠平衡測(cè)試6分，反射缺失或者異常活動(dòng)4分，最高分?jǐn)?shù)18分，最低分?jǐn)?shù)0分。將術(shù)后評(píng)分為7～12分的老鼠納入中度創(chuàng)傷性腦損傷模型，否則棄之不用。

1.2.3 制備石蠟切片和HE染色 各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)以10%水合氯醛（0.5 mL/kg）麻醉大鼠后，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，先用37 ℃生理鹽水200 mL經(jīng)心臟灌注，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，再用4%多聚甲醛200 mL灌注固定后斷頭取腦，經(jīng)10%中性甲醛固定24 h后，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋腦組織標(biāo)本。大鼠腦組織標(biāo)本冠狀面連續(xù)切片，厚度5 μm，HE染色方法嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)染色步驟進(jìn)行，光鏡下觀察細(xì)胞、組織排列及變化并照相。

1.2.4 MMP-9和AQP-4測(cè)定 采用抗生物素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合法（SABC）檢測(cè)MMP-9和AQP-4的陽(yáng)性表達(dá)。MMP-9和AQP-4兔抗鼠抗體（一抗）其工作效價(jià)1︰200；切片常規(guī)脫蠟，過(guò)氧化氫封閉，微波抗原修復(fù)20 min，血清封閉，分別滴加兔抗鼠MMP-9和AQP-4一抗，室溫孵育60 min。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5 min、3次，然后滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（二抗），室溫孵育20 min，PBS洗5 min、3次，DAB溶液顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來(lái)水終止反應(yīng)，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。免疫組化染色的切片行光鏡檢查，觀察其染色強(qiáng)度，MMP-9和AQP-4陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈棕色。在多功能顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)200×不重復(fù)視野進(jìn)行照相，圖像資料使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野陽(yáng)性染色區(qū)域的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及組間兩兩比較，方差不齊者采用非參數(shù)Kruskal Wallis檢驗(yàn)，P < 0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為評(píng)定

大鼠在顱腦損傷后立即出現(xiàn)前肢抱握屈曲、后肢強(qiáng)直、肌張力增高、不能直走、向一側(cè)打轉(zhuǎn)等表現(xiàn)。清醒后精神萎靡不振，活動(dòng)減少。術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分均在7～12分之間。

2.2 組織學(xué)觀察

光鏡下見(jiàn)假手術(shù)組皮層神經(jīng)細(xì)胞呈圓形或橢圓型，核膜完整，核仁清晰可見(jiàn)呈藍(lán)色淡染，周圍神經(jīng)纖維致密，著色均勻。傷后6 h組可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，體積增大，核膜不清，核仁深染偏位或消失（圖1）。48 h組神經(jīng)細(xì)胞周圍可見(jiàn)空隙，胞質(zhì)強(qiáng)烈嗜伊紅，核固縮。胞質(zhì)與胞核黏附在一起，稱為暗細(xì)胞，且數(shù)量增多，72 h組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和組織間隙水腫明顯，大量的多型核白細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞積聚在水腫帶。神經(jīng)元胞質(zhì)呈嚴(yán)重缺血性改變。7 d組暗細(xì)胞數(shù)量減少。假手術(shù)組無(wú)明顯變化。

2.3 腦組織中MMP-9和AQP-4的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示MMP-9隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)明顯增強(qiáng)，48 h達(dá)高峰，以后逐漸下降，7 d時(shí)下降到最低（圖2），在假手術(shù)組幾乎不表達(dá)，EPO治療組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。AQP-4在損傷后，表達(dá)水平迅速升高，24 h達(dá)最高水平，48 h后開(kāi)始下降，至7 d時(shí)仍高于正常水平（圖3），假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化，EPO治療組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

目前對(duì)于急性創(chuàng)傷性腦損傷尚缺乏完善的治療方法，治療的關(guān)鍵還是控制繼發(fā)性腦損害的發(fā)展。近年來(lái)研究表明，EPO在腦外傷中可通過(guò)[3]抗凋亡、抗氧化、減輕腦水腫、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、減少興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、抗炎癥[5]和促進(jìn)血管生成方面[6]等途徑對(duì)繼發(fā)性腦損害的發(fā)展發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)研究EPO對(duì)大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)作用，為臨床治療急性創(chuàng)傷性腦損傷奠定理論基礎(chǔ)。

MMP-9是MMPs中的重要明膠酶，在血管再生、炎性反應(yīng)、血腦屏障（BBB）的破壞中起重要作用，正常腦組織中MMP-9表達(dá)水平極低[7，8]。在腦創(chuàng)傷后，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和侵入的中性粒細(xì)胞均可大量表達(dá)。

AQP-4是促進(jìn)水轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜蛋白家族中的重要一員，是腦內(nèi)最主要的水通道蛋白，在大腦皮層呈低表達(dá)，主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞及室管膜細(xì)胞亞群中表達(dá)[9]，大鼠外傷性腦損傷損傷后誘發(fā)了血腦屏障的膠質(zhì)細(xì)胞胞膜AQP4的表達(dá)，促進(jìn)了體液能夠迅速通過(guò)毛細(xì)血管滲入神經(jīng)組織間隙是導(dǎo)致腦水腫的病理機(jī)制之一[10]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠腦損傷后，大腦皮層中的MMP-9和AQP-4的含量明顯增高，在不同的時(shí)間點(diǎn)含量不同，MMP-9在1～2 d達(dá)到高峰，3 d后開(kāi)始逐漸降低。AQP-4在24 h達(dá)到高峰，3 d后開(kāi)始降低。EPO治療組MMP-9和AQP-4含量均低于對(duì)照組，提示EPO有抑制MMP-9和AQP-4表達(dá)的作用。這說(shuō)明急性創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)展過(guò)程與MMP-9和AQP-4的表達(dá)密切相關(guān)。也證實(shí)了EPO可通過(guò)降低腦損傷后血清MMP-9和AQP-4含量，來(lái)抑制顱腦損傷后炎癥反應(yīng)的發(fā)生和腦水腫的發(fā)展，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

EPO的主要作用是促進(jìn)紅細(xì)胞生成，長(zhǎng)期、反復(fù)、大量的用藥將會(huì)導(dǎo)致血液黏稠、靜脈血栓、中風(fēng)的發(fā)生。最近Erbayraktar等[11]報(bào)道已經(jīng)研制出了缺乏唾液酸基的EPO，它無(wú)生成紅細(xì)胞的功能，半衰期短，能通過(guò)血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有完全的神經(jīng)保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)EPO神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行更深層次的探索和臨床實(shí)驗(yàn)，從而為進(jìn)一步探討外傷性腦損傷的發(fā)生機(jī)制及尋覓更有效的神經(jīng)保護(hù)措施提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2011-11-22）