Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)與食管鱗癌放療療效的關(guān)系

郝輝 李娟 李亞輝

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使我們能夠從蛋白水平、分子水平深入認(rèn)識(shí)食管癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。存活素(Survivin)是近年研究較多的凋亡抑制蛋白，在大多數(shù)人類腫瘤中其表達(dá)增多，與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、血管生成及其預(yù)后和耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)［1－3］。半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)則是涉及細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵的蛋白酶［4］，在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，直接介導(dǎo)下游的凋亡效應(yīng)。故本研究通過檢測56例食管癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)的相關(guān)性、與食管癌臨床分期及預(yù)后的關(guān)系，擬為臨床治療提供有益的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2010年1月至2011年1月放療前病理證實(shí)為食管鱗癌的內(nèi)窺鏡活檢標(biāo)本56例，全部患者均接受根治性放射治療，放療前后無其他輔助治療，放療采用6MV-X線直線加速器，腫瘤總劑量54～68 Gy，中位劑量60 Gy，2 Gy/次，1 次/d，5 d/周。其中男34 例，女22 例;年齡50～74歲，中位年齡65歲;胸上段10例，胸中段38例，胸下段 8例;病變長度≤5.0 cm 14 例，5.1 ～7.0 cm 20 例，7.1 ～10.0 cm 18例，＞10.0 cm 4例。依據(jù)2002年UICC食管癌國際 TNM 分期標(biāo)準(zhǔn):全組患者 T1、T2、T3、T4 期分別為 2、38、14、2例;N0、N1期分別為38、18例;臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為2、30、18、6 例。

1.2 檢測方法 采用免疫組化SP法，1∶50濃度稀釋的鼠抗人Survivin單克隆抗體，1∶75濃度稀釋的鼠抗人Caspase-3單克隆抗體及IgG二抗工作液、SP試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。染色步驟參照試劑說明書完成。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，HE染色。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 光鏡下觀察閱片，雙盲法計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，5個(gè)高倍視野(×200)計(jì)數(shù)取均值。Survivin陽性表達(dá)為胞漿或胞膜呈棕黃色顆粒，按Cai-De參考標(biāo)準(zhǔn)［5］:每個(gè)視野中均無著色細(xì)胞者或陽性細(xì)胞數(shù)＜25%者為陰性(－)，陽性細(xì)胞數(shù)≥25%者為陽性(+)(圖1)。Caspase-3陽性表達(dá)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒散在或彌漫片狀分布，按Iseki標(biāo)準(zhǔn)［6］，根據(jù) Caspase-3染色強(qiáng)弱及陽性細(xì)胞數(shù)兩個(gè)方面綜合判斷Caspase-3標(biāo)記指數(shù):a染色強(qiáng)度(0=無，1=弱，2=中，3=強(qiáng));b陽性細(xì)胞數(shù)(0=無陽性細(xì)胞，1=陽性細(xì)胞數(shù)＜25%，2=陽性細(xì)胞數(shù)25% ～50%，3=陽性細(xì)胞數(shù) ＞50%)，a、b相加的綜合得分即為Caspase-3陽性指數(shù)。用Caspase-3陽性指數(shù)大小來表示Caspase-3表達(dá)的高低:a+b得分為0～1，則陽性指數(shù)為0;a+b為2，則陽性指數(shù)為1;a+b為3，則陽性指數(shù)為2;a+b為4～5，則陽性指數(shù)為3;a+b為6，則陽性指數(shù)為4。綜合記分＜2為陰性表達(dá)(－)，≥2為陽性表達(dá)(+)。見圖2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)指標(biāo)之間及其與部分臨床病理因素之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射治療后近期療效評(píng)價(jià) 放射治療后達(dá)到完全緩解者12例，完全緩解率(CR)為21.4%，部分緩解者44例，部分緩解率(PR)為79.6%，總有效率100%。療后1年生存率61.4%，中位生存期14個(gè)月。觀察期內(nèi)已死亡16例，占28.6%(16/56)，其中復(fù)發(fā)7例，轉(zhuǎn)移4例，嘔血4例，心臟病1例。Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)對(duì)食管癌近期療效無明顯影響。

2.2 Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系 56例食管癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)的陽性率分別為28.57%(16/56)、53.57%(30/56)，兩者蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= －0.549，P=0.002)。

Kaplan-Merier單因素分析結(jié)果顯示:T分期、臨床分期、病變長度、Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)均與患者預(yù)后相關(guān)，而性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)分化程度與預(yù)后未顯示出明顯相關(guān)性。Survivin陰性表達(dá)者預(yù)后好于陽性表達(dá)者，Caspase-3陽性表達(dá)者預(yù)后好于陰性表達(dá)者(P ＜0.05)，見圖3、4，表1。

2.3 食管癌臨床分期與預(yù)后的關(guān)系 依據(jù)2002年UICC食管癌國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)56例食管癌患者進(jìn)行臨床分期，T1～2期40例患者預(yù)后明顯好于T3～4期16例患者(P=0.001)(圖5)。N分期對(duì)預(yù)后生存未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期32例患者較Ⅲ～Ⅳ期24例患者預(yù)后好(P=0.013)(圖 6)。

2.4 多因素生存分析 將性別、年齡、病變長度、部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、照射劑量、病理類型、T分期、N分期、臨床分期及Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)行Cox多因素分析顯示:Survivin蛋白表達(dá)、T分期、N分期與食管癌預(yù)后密切相關(guān)，Survivin蛋白陽性表達(dá)者及T、N分期較晚者預(yù)后差。見表2。

圖1 Survivin蛋白在食管鱗癌中陽性表達(dá)(HE×200)

圖2 Caspase-3蛋白在食管鱗癌中陽性表達(dá)(HE×200)

3 討論

圖3 Survivin蛋白表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖4 Caspase-3蛋白表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖5 T分期與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖6 臨床分期與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

表1 不同病理參數(shù)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

表2 多因素分析對(duì)食管癌患者預(yù)后的影響

凋亡的抑制蛋白因子(inhibitur of apoptosis protein，IAP)是一類抑制凋亡的調(diào)節(jié)分子，其成員Survivin是近來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，以細(xì)胞周期依賴的形式在G2/M期高表達(dá)，其過表達(dá)可促進(jìn)有絲分裂致使細(xì)胞異常增殖［7］。Caspase蛋白酶又名半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的核心，根據(jù)在細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用位置可分為:在上游調(diào)控其他Caspase活化的始動(dòng)Caspase(Caspase-1，2，4，5，8，9，10)和下游直接介導(dǎo)凋亡的效應(yīng)Caspase(Caspase-3，6，7，14)，Survivin 可通過直接或間接作用于Caspase家族，從而阻斷細(xì)胞的凋亡過程［8］。

近年來研究表明，Survivin在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，而且其表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)［6］。Kato等［9］采用RT-PCR技術(shù)檢測了51例食管癌中Survivin mRNA表達(dá)，顯示癌組織中Survivin陽性表達(dá)率為70.9%，并且Survivin的表達(dá)與患者術(shù)后生存期顯著相關(guān)，高表達(dá)者生存期短，提示Survivin表達(dá)增加有可能為判斷食管癌預(yù)后的指標(biāo)之一。Sarela等［10］在114例大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Survivin mRNA在腫瘤中表達(dá)陽性率高于癌旁組織，提示Survivin的表達(dá)在大腸癌的發(fā)生中有一定作用，同時(shí)Survivin的表達(dá)也與Ⅰ～Ⅲ期大腸癌患者的生存狀態(tài)顯著相關(guān)，低表達(dá)者生存期長。本研究亦顯示陽性表達(dá)組預(yù)后差，這與多數(shù)研究結(jié)果一致。說明Survivin蛋白表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，有可能成為食管癌預(yù)后不良的標(biāo)志物。

Jiun-Yi等［11］采用免疫組化技術(shù)檢測了40例食管癌手術(shù)標(biāo)本Caspase-3表達(dá)，陽性表達(dá)率60%，5年生存率25%，陰性表達(dá)率40%，5年生存率6%(P=0.02)，多因素分析:腫瘤分期、分化程度、Caspase-3表達(dá)均可作為預(yù)后因素，推測Caspase-3蛋白表達(dá)可作為獨(dú)立的評(píng)價(jià)食管癌預(yù)后良好的指標(biāo)。陳洪雷等［12］應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究大鼠肺鱗癌Caspase-3蛋白表達(dá)水平與其細(xì)胞增殖間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大鼠肺鱗癌Caspase-3陽性表達(dá)率44.12%，顯著低于對(duì)照組正常大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞(P ＜0.01)及癌前病變組(P ＜0.05)，有可能Caspase-3參與了正常支氣管黏膜上皮細(xì)胞的發(fā)育、轉(zhuǎn)化及細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)。本研究單因素分析亦顯示Caspase-3陽性表達(dá)者預(yù)后差，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。Caspase-3缺失表達(dá)阻斷了Caspase家族凋亡途徑的下游效應(yīng)因子，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，從而賦予腫瘤細(xì)胞惡性增殖的生物學(xué)行為，Caspase-3蛋白表達(dá)可作為判斷食管癌預(yù)后的指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，隨著Survivin在食管癌組織中表達(dá)量的升高或降低，Caspase-3的表達(dá)量呈升高或降低趨勢，通過直線相關(guān)分析可以看到二者呈負(fù)相關(guān)，更證實(shí)了Survivin通過抑制Caspase活性，阻斷細(xì)胞凋亡，故聯(lián)合檢測兩者蛋白有望提高判斷預(yù)后的價(jià)值。

雖然Survivin和Caspase-3在食管癌組織中的表達(dá)與食管惡性腫瘤的生物學(xué)行為和臨床行為的關(guān)系及其作用機(jī)制尚不十分明了，但通過檢測兩者蛋白在食管癌中的表達(dá)，可能為臨床治療方案的選擇和放射治療療效的評(píng)估提供一個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)。隨著分子生物學(xué)研究的深入，多基因聯(lián)合的基因治療將會(huì)為食管惡性腫瘤的治療開辟一個(gè)新的領(lǐng)域。

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