自體骨髓在兔腰椎橫突間融合中誘導成骨的組織學評估

蘇旻罡 劉志國 夏鐵成 郝建學 張建鵬

脊柱融合術是脊柱外科的基本手術之一，后外側橫突間、小關節突間融合是目前常用的方法，但假關節發生率較高，據報道為20% ～50%［1］。自體骨髓內含有骨髓基質干細胞，具有成骨能力。本實驗通過研究自體骨髓在腰椎橫突間融合中誘導成骨的作用，探討其作為骨移植添加物的效果，為臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與手術 健康、骨骼成熟中國白兔24只(由河北大學附屬醫院實驗中心提供，清潔級動物，普通環境、單籠喂養，飼喂質量合格的全價飼料)，雌雄不限，體重3～3.5 kg，隨機分為實驗組(14只)和對照組(10只)。腹腔內注射硫賁妥鈉(30 mg/kg)，如麻醉效果差，加用0.5%普魯卡因局部浸潤。腰5、6棘突為中心做后正中切口，自椎旁肌外側向前分離肌肉，顯露雙側5、6腰椎橫突，去除后方骨皮質，取一側髂骨約1 g修剪成約0.3 cm3骨塊，每側橫突間植入約0.5 g。實驗組從另一側髂骨一點穿刺抽取2 ml骨髓，抽吸前注射器內取0.1 ml肝素鈉液，2 ml與髂骨塊充分混勻放置數分鐘，每側融合區各植入0.5 g自體髂骨和1 ml自體骨髓的混合物。術后單籠喂養，未用外固定。術后4周每組各處死2只動物，8、12周，實驗組和對照組每批分別處死6、4只動物。脊柱標本立即放入4℃、10%甲醛固定3～4 d。

1.2 觀察指標 組織學觀察:將所有4、8、12周標本制成組織切片，再經過HE染色后觀察各時期融合骨塊生長情況，具體步驟:將固定好的標本去除附帶的肌肉組織，放入8%甲酸液中脫鈣，直至針刺椎體見其變軟。取出標本，清水沖洗干凈，將融合區切下，切成3×2×0.4 cm3小塊。將標本編號后放入脫水盒中，室溫下經不同濃度乙醇各脫水、氯仿透明、浸蠟包埋、切片。然后經過烤片、脫蠟。最后經HE染色、組織學觀察分析。

2 結果

2.1 實驗組 4周時見大量新生骨小梁，內有較成熟骨髓組織(圖1)。8周時成熟骨小梁明顯增多，成骨細胞能力明顯降低。成熟骨小梁表面破骨細胞數量多，進入塑形改造階段(圖2)。12周時，新生骨小梁罕見，可見大量板層骨，表面的成骨細胞明顯減少，可見成熟骨髓組織，表面塑形改造已經完成(圖3)。

2.2 對照組 新生骨小梁少，發育相對滯后。移植骨被纖維組織和破骨細胞包圍，表明移植骨被吸收(圖4)。8周時新生、成熟骨小梁均可見到，新生骨小梁較多，成骨細胞能力弱，成熟骨小梁明顯少于同時期的實驗組(圖5)。12周時，成熟骨小梁數量明顯少于實驗組。成骨細胞數目較8周時明顯減少，成骨能力明顯減弱(圖6)。

2.3 2組比較 各時期實驗組成骨方式始終以膜內成骨為主，軟骨成骨為輔，對照組則相反。

圖1 實驗組4周標本切片可見:大量新生骨小梁(粉染)，內有大量骨細胞(紫染)，可見骨髓組織(HE×100)

圖2 實驗組8周標本切片可見:成熟骨小梁明顯增多(粉染)，成骨細胞的能力明顯降低，可見較多的破骨細胞(紫染)，表明新生骨已經進入塑形改造階段，可見成熟的骨髓組織(HE×100)

圖3 實驗組12周標本切片可見:新生骨小梁罕見，可見大量板層骨，表面的成骨細胞明顯減少，內有成熟骨髓組織，新生骨塑形改造已經完成(HE×400)

3 討論

圖4 對照組4周標本切片可見新生骨小梁少，發育相對滯后，移植骨被纖維組織和破骨細胞包圍，表明移植骨被吸收(HE×100)

圖5 對照組8周標本切片可見:新生、較成熟骨小梁均存在，新生骨小梁較多，成骨細胞能力弱，成熟骨小梁明顯少于同時期的實驗組(HE×100)

圖6 對照組12周標本切片可見:成熟骨小梁數量明顯少于實驗組(HE×400)

自體髂骨是較理想的骨移植物，具有成骨所需要的骨誘導和骨傳導作用，但其來源有限，特別對于假關節形成需二次手術、需多節段融合及小兒脊柱側彎矯形的患者。而且，取骨區并發癥較多，發生率6%～25%。目前，有多種骨移植材料用于脊柱融合，然而其費用昂貴并可能形成異位骨化，而且某些臨床實驗性應用顯示其效果等同于自體髂骨移植。近些年，同種異體骨融合效果日益提高［1］，但仍然存在交叉感染疾病、免疫排斥反應的風險。而且，Butterman等［2］發現，胸腰椎后路融合應該使用自體髂骨移植。目前研究較多的骨髓基質干細胞體外培養擴增后，復合載體用于脊柱融合，成骨作用強，融合率高［2］。但目前僅限于實驗研究，而且對技術設備要求高，只能手術植入，不能經皮注射。

自體骨髓內的紅骨髓含有造血細胞和骨髓基質，骨髓基質中含多能干細胞，Owen［3］稱之為骨髓基質干細胞，其可以在無誘導下骨化，稱為確定性骨源性前體細胞(determined osteogenic precursor cells，DOPC)，也稱為骨源性干細胞(osteogenic stem cells)。Turksen等［4］證明，DOPC體外培養逐步分化成骨源性干細胞→骨祖細胞→前成骨細胞→成骨細胞→骨細胞。

目前，國內外許多學者報道了臨床應用自體骨髓移植治療骨折延遲愈合、不愈合、骨缺損和骨囊腫，涉及到脛骨、股骨、肱骨、手舟骨等，效果較好［5－8］。

本實驗組織學評估可見，各個時期中實驗組骨小梁數量、成熟度、形成時間均明顯優于對照組。因此本實驗組可以證實，自體骨髓在兔腰椎橫突間融合模型中，是一種有效可靠的骨移植添加物，可以減少自體髂骨的用量，但融合效果優于單純應用自體髂骨移植。主要表現為融合時間較短、成骨量較多、融合牢固。自體骨髓來源充足，獲取方便，而且可以反復獲取，治療費用低，無傳染疾病、免疫排斥反應的風險，供骨區并發癥較少。是有效、安全、經濟的移植添加物。

1 Friedlander GE，Clayton RP，Cole DJ，et al.Osteogenic Protein-1(BMP-7)in the treatment of tibial nonunions.JBJS(Am)，2001，83:151-158.

2 Butterman GR，Glazer PA，Bradford DS.The use of bone allografts in the spine.Clin Orthop，1996，324:75.

3 Owen ME.Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system.In:Peck WA，eds.Bone and Mineral Research.Amsterdam:Elsevier，1984.1-25.

4 Turksen K，Aubin JE.Positive and negative immunoselection for enrichment of tow classes of osteoprogenitor cells.J Cell Biol，1991，114:373-384.

5 梁雨田，張伯勛，盧世壁.經皮自體骨髓移植在骨缺損瘢痕組織內成骨作用的實驗研究與臨床應用.中國修復重建外科雜志，1999，13:148-151.

6 王恒冰，王繼孟，郭宗遠.自體骨髓移植治療小兒孤立性骨囊腫的初步觀察.中華小兒外科雜志，2002，23:68.

7 徐耀增，王曉東，董天華.自體骨髓經皮注射治療骨延遲愈合和骨不連.中國矯形外科雜志，2003，11:584-586.

8 Connolly JF，Guse R，Tiedeman J，et al.Autologous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibal nonunious.Clin Orthop，1991，266:259-270.