Survivin基因啟動子區-31C＞G功能性多態與卵巢癌遺傳易感性的關聯研究

靳麗娟 霍京麗 張素花

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，因其起病隱匿，惡性程度高，多數患者就診時已是晚期，盡管近年來手術、化學藥物治療和放射治療技術不斷改進，5年生存率仍無明顯提高。因此，研究卵巢癌的發病機制、尋找新的診斷和治療靶點，已經成為提高其預防和治療效果的當務之急。Survivin基因位于人類染色體17q25，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，具有抑制細胞凋亡和調節細胞增殖的雙重功能［1］。已有研究證實，Survivin蛋白在卵巢上皮性癌組織中呈異常高表達，與卵巢癌的發生、發展密切相關［2－4］。存在于Survivin基因上的多態位點可能影響survivin基因的轉錄活性和表達水平。例如，位于survivin基因啟動子區的-31C＞G多態可通過改變CDE/CHR調控元件結合位點的特異序列，增加阻遏蛋白與CDE/CHR元件結合，進而影響腫瘤的遺傳易感性［5，6］。已有報道顯示-31C＞G多態與肺癌［5］、腎癌［7］、膀胱癌［8］、胃癌［9］、食管癌［10］、結腸癌［11］等多種惡性腫瘤的發病風險相關，但未見與卵巢癌發病風險的病例對照研究。本研究采用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應(polymerase chain reaction-ligase detection reac-tion，PCRLDR)技術，通過基于醫院的病例-對照研究，探討中國北方漢族人群survivin基因啟動子區-31C＞G多態與卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)發病風險的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 138例卵巢上皮性癌患者(病例組)為2006年至2011年在筆者所在醫院進行手術治療的北方漢族女性，術前未行放射或化學治療，術后標本均經病理學證實，其中漿液性癌52例，黏液性癌17例，宮內膜樣癌50例和低分化腺癌19例;臨床分期采用國際婦產科聯盟(FIGO)標準(2000年)，其中早期(Ⅰ～Ⅱ期)卵巢癌47例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)卵巢癌91例;確診時年齡＜50歲患者49例，≥50歲患者89例。另選擇同一地區138例健康婦女作為對照組，對照組女性均無腫瘤和遺傳病史。所有研究對象均有知情同意。

1.2 DNA提取 抽取患者及對照個體靜脈血5 ml，以枸櫞酸鈉抗凝，采用Miller等［12］的蛋白酶K－氯化鈉鹽析法提取白細胞DNA。

1.3 基因多態性檢測 采用PCR-LDR方法進行基因型檢測。擴增-31C＞G SNP位點的上、下游引物序列分別為5’-CGCCTCTACTCCCAGAAGGC-3’和 5’-GAGATGCGGTGGTCCTTGAGAA-3’，擴增片段為187 bp。PCR 反應體系為 15 μl，其中模板 DNA 1 μl，10 × PCR 緩沖液和 MgCl2各 1.5 μl，Taq-DNA聚合酶 0.2 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μl，DMSO 0.2 μl，上、下游引物各0.25 μl。PCR反應條件為:94℃ 2 min預變性后，94℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸25 s，35 個循環后，72℃繼續延伸3 min。根據LDR探針設計原則設計LDR的熒光探針，特異性探針1(針對C堿基)為5’-CATTAACCGCCAGATTTGAATCGCC-3’;特異性探針2(針對G堿基)為5’-TTTCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCG-3’。通用探針為的 5’-P-GGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCG-FAM-3’。LDR反應體系:1×Buffer緩沖液 1 μl，探針混合液 0.03 μl，連接酶 0.125 μl，PCR產物2 μl，PCR 專用水補齊至10 μl。反應條件:95℃ 30 s，56℃2 min，進行35個循環。基因分型如圖1所示。

圖1 Survivin基因-31C＞G多態分型(PCR-LDR法)

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，擬合優度χ2檢驗(df=1)進行Hardy-Weinberg平衡分析2組的基因型頻率及等位基因型分布比較采用χ2檢驗，應用非條件Logistic回歸模型計算OR值和95%CI，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般特征 病例組年齡19～64歲，中位年齡51歲;對照組年齡22～62歲，中位年齡49歲;2組年齡比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。對照survivin基因-31C＞G多態的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.44，P=0.51)。

2.2 Survivin基因-31C＞G多態與卵巢癌的關系 Survivin基因-31C＞G多態三種基因型(GG、CG、CC)頻率在病例組中分別為 17.4%、46.4% 和 36.2%，與對照組(28.3%、47.1% 和24.6%)相比差異有統計學意義(χ2=6.627，P=0.036);病例組C等位基因頻率(59.4%)顯著高于對照組(48.2%)，差異有統計學意義(χ2=7.004，P=0.008)。見表1。

表1 Survivin基因-31C＞G多態的基因型及等位基因型頻率分布n=276，例(%)

2.3 Survivin基因-31C＞G多態與卵巢上皮性癌發病風險的關聯 與GG基因型相比，CC基因型能增加EOC的發病風險(OR 值為2.39，95%CI為 1.22-4.67);與 G 等位基因相比，C等位基因亦能增加EOC的發病風險(OR值為1.57，95%CI為1.12～2.21);同時進行基因的顯性模型和隱性模型分析發現，C等位基因無論作為隱性基因還是顯性基因均能增加EOC的發病風險。見表2。

表2 Survivin基因-31C＞G多態與卵巢上皮性癌發病風險的關聯n=276，例

3 討論

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，其發病隱匿、進展迅速，70% ～80%的患者發現時已為晚期［1］。但迄今為止，卵巢癌的發病機制尚不清楚。研究顯示遺傳易感性可能在其發生中起重要作用。Survivin基因作為一個重要的遺傳候選基因，由于具有抑制細胞凋亡和調節細胞增殖的雙重功能，近年來成為研究的熱點。

腫瘤是一個多基因參與的與細胞周期紊亂和凋亡受阻密切相關的疾病。Survivin基因位于人類染色體17q25，基因全長為14.7 kb，由3個內含子和4個外顯子組成，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，廣泛表達于人類胚胎組織和惡性腫瘤組織中，但不表達于正常組織和終末分化的成人組織。大量的研究證實，Survivin蛋白的高表達在腫瘤發生發展過程中起著重要的作用［2－4］。

存在于Survivin基因上的SNP位點可能影響基因的轉錄活性和表達水平，從而影響腫瘤的發生。-31C＞G多態位于啟動子區細胞周期依賴性元件(cell cycle dependent element，CDE)/細胞周期同源區(cell cycle homology region，CHR)，-31G變異等位基因通過改變CDE/CHR調控元件結合位點的特異序列增加阻遏蛋白與CDE/CHR元件結合，從而降低survivin的表達，進而影響腫瘤遺傳易感性［5－6］。

國內外有關Survivin基因與腫瘤關系的研究多集中在mRNA表達和蛋白表達水平上。例如，夏爽等［2］的研究顯示Survivin基因表達與卵巢上皮性癌的病理類型和淋巴結轉移顯著相關。高慶等［3］的研究顯示Survivin蛋白在卵巢癌組織中的表達顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織，且與病理分期、細胞分化程度有關(Survivin蛋白在Ⅲ～Ⅳ期惡性上皮性卵巢腫瘤組中的陽性表達高于Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織，在低分化惡性上皮性卵巢腫瘤組織中的陽性表達高于中、高分化腫瘤組)。馬志松等［4］的研究也顯示Survivin表達和癌細胞分化程度、淋巴結轉移存在相關性。但關于Survivin基因啟動子區-31C＞G功能性多態位點與腫瘤發病風險關系的研究國內外報道還很少，共查到相關文獻20余篇，多為和胃癌、結直腸癌等消化道腫瘤的相關報道，未見與卵巢癌發病風險的病例-對照研究。其中Han等［13］進行了該位點和卵巢癌發病年齡的研究，發現攜帶CC基因型的患者發病年齡平均為57.1歲，較GG基因型攜帶者發病年齡提前(62.8歲)。

本研究結果提示survivin基因-31C＞G功能性多態可能與中國北方漢族女性EOC的發病風險有關，這與程正江等［14］和黃俊等［15］對胃癌和結直腸癌的研究結果相似。這就從蛋白水平、轉錄水平和基因水平同時驗證了該多態與卵巢癌的關系:－31C等位基因影響CDE/CHR調控元件結合位點的特異序列，減少阻遏蛋白與CDE/CHR元件結合，從而上調survivin蛋白表達，進而在卵巢癌的發生發展中發揮作用。

總之，本研究結果顯示，survivin基因-31C＞G多態與卵巢癌的發病風險相關，提示該功能性位點可能是卵巢上皮性癌的一個有意義的分子標志物。

1 Li F，Brattain MG.Role of the Survivin gene in pathophysiology.Am J Pathol，2006，169:1-11.

2 夏爽，傅芬.COX-2、Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表達及與臨床病理因素的關系.江西醫學院學報，2006，46:70-73.

3 高慶，邢蘭英，王詠雪，等.P-糖蛋白、Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表達及其與卵巢癌耐藥的關系.西安交通大學學報(醫學版)，2007，28:578-581.

4 馬志松，黃永生，蘇悅.卵巢上皮性癌組織中survivin與p53表達的研究.實用醫藥雜志，2011，28:301-304.

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7 Qin C，Cao Q，Li P，et al.Functional promoter-31G ＞ C variant in survivin gene is associated with risk and progression of renal cell cancer in a Chinese population.PLoS One，2012，7:e28829.

8 Jaiswal PK，Goel A，Mandhani A，et al.Functional polymorphisms in promoter survivin gene and its association with susceptibility to bladder cancer in North Indian cohort.Mol Biol Rep，2012，39:5615-5621.

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11 Gazouli M，Tzanakis N，Rallis G，et al.Survivin-31G/C promoter polymorphism and sporadic colorectal cancer.Int J Colorectal Dis，2009，24:145-150.

12 Miller SA，Dykes DD，Polesky HF.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acid Res，1988，16:1215-1215.

13 Han CH，Wei Q，Lu KK，et al.Polymorphisms in the survivin promoter are associated with age of onset of ovarian cancer.Int J Clin Exp Med，2009，2:289-299.

14 程正江，胡麗華，黃少軍.Survivin啟動子區域-31G/C多態性與胃癌發生的關系(英文).癌癥，2008，27:258-263.

15 黃俊，汪建平，王磊，等.survivin基因啟動子區-31C/G多態性與散發性結直腸癌遺傳易感性的關系.中國病理生理雜志，2009，25:2344-2348.