卵巢上皮癌中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達及臨床意義

尚素霜 程佳 張靜 任月環 張利玲 于華 霍艷

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，目前其發病機制仍不清楚。由于卵巢的解剖位置隱蔽，卵巢癌具有發現晚、轉移早等特點。所以如何控制卵巢癌的血管生成和轉移就成為治療卵巢癌、提高患者生存率的關鍵。目前晚期卵巢癌患者施行理想的腫瘤細胞減滅術較為困難，因此化療對于卵巢癌治療的成敗具有決定性作用。但因為獲得性耐藥約占70%～80%，腫瘤細胞對化療藥物(尤其是鉑類)產生耐藥性是導致卵巢癌綜合治療失敗的關鍵因素。目前對卵巢癌耐藥機制研究的焦點已逐漸集中到細胞內的信號轉導通路，本實驗應用免疫組化技術檢測58例卵巢上皮癌中人類表皮生長因子受體2(HER-2)、拓撲異構酶Ⅱ(Topo-Ⅱα)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)組織中的表達、相互關系及臨床意義，為卵巢癌有效治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 標本 選擇2008年10月至2009年12月我院住院患者手術標本存檔的88份蠟塊，其中正常卵巢組織10份(對照組)，卵巢良性上皮腫瘤組織20份(良性組)，卵巢上皮癌組織58份(卵巢癌組)。對照組患者年齡30～58歲，中位年齡44歲;良性組患者年齡18～50歲，中位年齡37歲;卵巢癌組患者年齡35～73歲，中位年齡56歲。3組年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。卵巢癌組病理分級:高、中分化33例，低分化25例;手術病理分期按國際婦產科聯盟(FIGO，1988年)的標準:Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期36例;漿液性42例，黏液性16例。所有患者均為初發，術前均未接受過放、化療。

1.2 主要實驗試劑 鼠抗人HER-2單克隆抗體(工作濃度1∶50)，鼠抗人TOPO-Ⅱα單克隆抗體(工作濃度1∶50)，均購自Santa Cruz公司。兔抗人PI3K單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。過氧化物酶標記的鏈霉卵白素標記盒(SP)試劑盒、DAB顯色劑等均購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色方法及結果判定 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法對HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達進行檢測。每批染色均設陰性和陽性對照。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽性對照取已知HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K表達陽性的乳腺癌組織的石蠟切片。本實驗染色判斷標準:(1)根據陽性細胞的比例計分:光學顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，陽性細胞比例計算方法為陽性細胞數占總細胞數的百分比，取其平均值。①1分:陽性細胞比例≤10%;②2分:陽性細胞比例為10% ～50%;③3分:陽性細胞比例為50% ～75%;④4分:陽性細胞比例≥75%。(2)根據陽性細胞染色強度計分:0分:細胞無顯色;1分:淺黃色;2分:棕黃色;3分:黃褐色。陽性細胞比例與細胞染色強度積分的乘積為每例標本的最終積分，范圍為0～12分，其中0分為(－)，1～4分(﹢)，5～8分為(﹢﹢)，9～12分為(﹢﹢﹢)。陽性表達率的計算方法為陽性表達細胞數/總細胞數×100%。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達與臨床病理指標間的關系分別采用χ2檢驗、Spearman等級相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達 卵巢上皮癌組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K陽性表達率顯著高于卵巢正常組織和良性組織(P＜0.05)，卵巢良性組織與正常組織間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達與卵巢上皮癌手術病理分期、組織學分級有關(P＜0.05)，而與年齡、病理類型無關(P ＞0.05)。見表2。

2.3 HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K在卵巢上皮癌中表達的相關性 HER-2和TOPO-Ⅱα蛋白陽性表達之間呈正相關(rs=0.455，P=0.000);HER-2和PI3K蛋白陽性表達之間呈正相關(rs=0.285，P=0.285);TOPO-Ⅱα 和 PI3K 蛋白陽性表達之間呈正相關(rs=0.311，P=0.017)。見表3。

表1 卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達 例(%)

表2 卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K表達的相關因素 例(%)

表3 卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K表達的相關性 例

3 討論

原癌基因與細胞的正常生命活動密切相關，發生突變后導致細胞增殖、分化平衡的失調。癌基因活化、抑癌基因缺失在細胞惡性轉化中起主導作用。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，定位于細胞膜，編碼分子量170kD的跨膜糖蛋白，廣泛分布于哺乳動物除血管外的上皮細胞膜上［1］。EGFR家族還包括 c-erbB-2、c-erbB-3 和 c-erbB-4［2］。C-erbB2 是人類腫瘤常發生改變的一個癌基因，HER-2在細胞信號轉導中占重要地位，可啟動細胞內強大的信號轉導網絡，引發一連串“瀑布”式反應，影響腫瘤細胞的生長、分化、轉移和黏附。大量研究表明，HER-2在許多腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等中擴增或者過表達。Trastuzumab-C-erbB2人源化單克隆抗體已成功用于治療C-erbB2過度表達的晚期乳腺癌患者。人源性抗HER-2單克隆抗體Herceptin(赫賽汀)，可與HER-2的胞外位點相結合，抑制HER-2過表達的腫瘤細胞生長。目前，Herceptin聯合紫杉醇及其他藥物治療卵巢癌的實驗仍在進行中。PIK3A 43.2%，p-AKT 51.6%。結果表明，HER-1、HER-2 在卵巢癌的發生發展過程中起一定的作用并可作為該疾病預后的特異性指標。因此HER-2不但可作為反映惡性腫瘤惡性生物學特性的指標，而且為治療腫瘤提出了新的理念及可能的相關治療方法。

本研究結果顯示:HER-2在卵巢上皮癌的陽性表達率為46.6%，而在正常卵巢組織及良性卵巢上皮腫瘤的表達率較低，惡性組與良性組及對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，而良性組與對照組之間比較差異無統計學意義 (P＞0.05)，提示HER-2在卵巢上皮癌的發生發展過程中起重要作用;臨床期別越晚，HER-2蛋白表達率也越高，Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期的陽性表達率分別為27.3%、58.3%，2組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，表明HER-2的表達與臨床分期有關;研究顯示腫瘤分化程度越差，HER-2的陽性表達率也越高，表明HER-2的表達與組織學分級有關(P＜0.05);對不同年齡階段及不同組織學類型HER-2的表達情況進行分析后結果表明HER-2的表達與年齡和組織學類型無關。

TOPO-Ⅱ又稱旋轉酶(gyrase)，有兩個α亞基和兩個β亞基。α亞基具有磷酸二酯酶活性，β亞基具有DNA依賴的ATP酶活性。TOPO-Ⅱα是DNA復制的重要核酶，與惡性腫瘤的增生及化療耐藥密切相關。研究表明，在多種惡性腫瘤中Topo II α的表達水平增高是一個普遍現象，而且臨床方面已逐漸將TOPO-Ⅱα作為一個標志，以判斷細胞或腫瘤的增殖程度［3，4］。Falck等［5］研究TOPO-Ⅱα等基因在卵巢漿液性腫瘤中的表達情況，免疫組化方法顯示41例漿液性卵巢癌組織TOPO-Ⅱα的陽性率在30.2% ～59.7%，卡方檢驗顯示TOPO-Ⅱα與臨床分期(P=0.0034)，組織分化程度(P=0.0076)及預后(P=0.0011)均有關。

TOPO-Ⅱ抑制劑是一類以TOPO-Ⅱ為靶點的抗腫瘤藥物，以拓撲異構酶為靶點，選擇性抑制增殖期DNA復制細胞，集中殺傷腫瘤細胞。Topo-Ⅱα表達降低使腫瘤細胞對多種抗癌藥產生耐藥，Topo-Ⅱα含量的高低，可以作為判定各種腫瘤對抗癌藥物的敏感性或抗藥性的指標。

本實驗結果顯示:TOPO-Ⅱα在卵巢上皮癌的陽性表達率為53.4%，而在良性卵巢組織及正常卵巢組織的表達率較低，與良性組、對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。而良性組與對照組比較差異無統計學意義，反映了TOPO-Ⅱα與腫瘤細胞的增殖程度有關。研究結果還顯示，TOPO-Ⅱα的表達與組織分化和臨床分期顯著相關，在高分化，中低分化卵巢上皮癌組織中TOPO-Ⅱα的陽性表達率分別為36.4%、76.0%，差異有統計學意義(P ＜0.05)，TOPO-Ⅱα在臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期的陽性表達率分別為31.8%、66.7%，差異有統計學意義(P＜0.05)。這說明腫瘤細胞的分化越差，臨床分期越晚，TOPO-Ⅱα的陽性表達率越高，提示腫瘤的的預后不良并表明腫瘤細胞的增殖程度很高。TOPO-Ⅱα在卵巢上皮癌組織中的表達與年齡和組織類型無關。

PI3K是二聚體，主要由一個催化亞基p110和一個調節亞基p85組成。它是生長因子受體超家族信號轉導途徑中的一個關鍵分子，在促進細胞生長、抑制細胞凋亡、維持細胞生存等機制中具有重要作用［6］。PI3K/Akt是與細胞增殖和細胞凋亡關系最密切的信號傳導通路之一［7］。IA型PI3K是酪氨酸激酶受體(如HER2)傳遞信號的重要轉導子［8］。細胞膜HER2受生長因子等刺激后，細胞內PI3K活化，進而磷酸化其底物PIP2使其轉化為 PIP3［9］。Akt(蛋白激酶 B，PKB)和 PIP3結合，前者的Thr308和Ser474位點因磷酸化而被激活［10］，活化的Akt可能進一步激活其下游分子mTOR等［11］。Ning等［12］在所培養的人卵巢癌細胞系OVCAR-3和 A2780/CP70中加入PI3K抑制劑LY294002，可抑制卵巢癌細胞增殖，并引起細胞周期停滯。有研究發現，順鉑可以下調卵巢癌細胞株中的AKT磷酸化和活性，PI3K活性抑制劑可以明顯提高順鉑對耐藥細胞株誘導的細胞毒性和凋亡效應，提示耐藥株對順鉑的化療抵抗至少一定程度上是源于PI3K/AKT信號轉導途徑的激活［9］。

本研究顯示PI3K蛋白在正常卵巢組織細胞和卵巢良性腫瘤組織中呈現不表達或弱表達，而在卵巢癌細胞中表達較強，且主要定位于胞核中。卵巢癌分化越差PI3K蛋白表達強度越強(P＜0.05);臨床分期越晚，PI3K陽性表達率也越高(P＜0.05)。提示PI3K在卵巢癌發生發展過程中起重要作用。

HER-2/neu能夠發生自身激活，通過PI3K/Akt通路，導致惡性腫瘤的發生。TOPO-Ⅱα基因與HER-2基因均定位于染色體17q12-q21，C-erbB-2表達增高還可激活Ras-MAPK或PI3-K等信號傳導因子，促進增殖，間接促進TOPO-Ⅱα表達增加。研究發現，Akt的磷酸化水平從正常乳腺上皮組織、不典型增生到惡性轉化，再到腫瘤侵襲轉移漸次增加，且與HER2的過表達呈正相關。已經發現在卵巢癌細胞中PI3K催化亞單位(P110)的擴增和AKT的變異。在不同類型的腫瘤中發現此信號通路的失調控表達，系列研究表明PI3K/AKT信號轉導途徑是卵巢癌細胞對順鉑敏感性的關鍵調控因素。HER-2，TOPO-Ⅱα，PI3K在多種惡性腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、胃癌等均有共同的過度表達并且具有相關性，提示在卵巢癌的發生發展及化療耐藥過程中可能起協同作用，并為治療卵巢癌提供新的理念。

本研究結果顯示卵巢上皮癌中HER-2分別與TOPO-Ⅱα、PI3K的表達之間均呈正相關(P ＜0.05)，TOPO-Ⅱα與PI3K的表達呈正相關(P＜0.05)。提示三者協同促進卵巢上皮癌的發生、發展及侵襲、轉移有關，對臨床治療及預后判斷具有重要的指導意義。

綜上所述，本實驗應用免疫組化方法，檢測HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K在卵巢上皮癌表達情況并對其臨床意義進行分析，提示HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K對促進卵巢癌的發生、發展、浸潤和轉移起重要作用，并與患者預后有關。原癌基因HER-2是近幾年來防治腫瘤的一個重要靶點，TOPO-Ⅱα抑制劑是目前卵巢上皮癌化療的常用藥物，PI3K/AKT在惡性腫瘤發生，增殖，轉移，血管生成及化學耐藥中的作用，以該通路為靶點的特異性或非特異性抑制劑在腫瘤治療中有著廣闊的應用前景。因此研究三者之間的關系將會進一步加深對卵巢癌發病機制的理解，并為卵巢癌有效治療提供新思路。

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