兩種PARP-1抑制劑對羥基喜樹堿誘導ECA-109細胞增殖及凋亡的影響

鄭永仁 何曉山 王 礡 楊曉密

云南中醫學院實驗中心，云南昆明 650500

喜樹堿（camptothecin，CPT）羥基喜樹堿（hydroxy camptothecin，HCPT）是一種植物抗癌藥物，在臨床上已廣泛用于食管癌、胃癌、腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療[1-5]。盡管HCPT對于多數腫瘤細胞均有殺傷作用，但其不良反應較多且嚴重，限制了它的臨床應用。因此，探索其影響腫瘤作用的各種相關因素具有十分重要的意義。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]是一種多功能核蛋白，廣泛參與DNA損傷的識別和信號轉導過程，尤其在DNA的堿基切除修復過程中發揮著無法替代的作用，是當今腫瘤基因治療的一個新靶點[6]。抑制PARP活性能降低腫瘤細胞的DNA修復功能，從而提高腫瘤放療和化療療效。研究表明，無論對于單一用藥或聯合化療藥物，PARP抑制劑都顯示了在抗腫瘤治療領域的潛力[7-8]。

NU1025和AG14361分別是第2代和第3代PARP抑制劑的代表，二者均能顯著提高化療藥物的細胞毒性作用，即對腫瘤細胞產生很強的化學致敏效果[9-10]。本研究探討了NU1025和AG14361與食管癌常用化療藥HCPT聯用對食管癌細胞ECA-109的增殖與凋亡的影響，并通過彗星實驗觀察細胞DNA損傷水平的變化，以初步探討二者與HCPT聯用的可能機制，為食管癌的臨床治療提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

人食管癌細胞株ECA-109購買于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。胎牛血清、DMEM培養基為美國Gibco公司生產。HCPT購自深圳萬樂藥業有限公司（批號：0708G1，2mg/瓶）。NU1025（編 號：493800）和 AG14361（編號：S2178）分別為德國Merck公司和美國Selleck公司產品。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發展有限公司提供。四甲基偶氮唑藍（four methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）產自美國Sigma-Aldrich公司。其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 ECA-109細胞用DMEM培養液培養（含10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 U/mL）于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。每2天傳代1次。

1.2.2 MTT試驗 取對數生長期的ECA-109細胞，接種到96孔板（100 μL/孔，約3.0×103/孔），待細胞貼壁后進行實驗處理。HCPT濃度參照本課題組預實驗結果及國內其他文獻報道，選用10 μmol/L。細胞隨機分成兩組，其中第1組采用以下方式處理：（1）對照組（不加任何處理）；（2）1.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組；（3）5.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組；（4）5.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組。第 2 組采用以下方式處理：（1）對照組（不加任何處理）；（2）10 μmol/L HCPT 處 理 組；（3）HCPT+1.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組；（4）HCPT+5.0 μmol/L NU1025或 AG14361處理組；（5）HCPT+5.0 μmol/L NU1025（或AG14361）處理組。每組設6個平行孔，24 h后，每孔加入6 mg/mL的MTT 20 μL，37℃繼續孵育4 h，棄上清，加入150 μL二甲基亞砜溶解甲瓚結晶，后于酶標儀上測定570 nm處的吸光度OD值，計算細胞增值率。計算公式為：細胞增殖率=處理組OD值／對照組OD值×l00%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的ECA-109細胞，以6×104個細胞接種于6孔培養板，待細胞貼壁后進行處理。細胞分組按1.2.2第2組，按相應方法處理ECA-109細胞24 h后收集細胞，制備成濃度為3.0×106/mL單細胞懸液，取80 μL細胞懸液，加入320 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混勻，室溫避光孵育20 min后，由專業技術人員檢測。

1.2.4 彗星實驗檢測細胞DNA損傷 選取對數生長期的ECA-109細胞，以3×104個細胞接種于6孔培養板，待細胞貼壁后進行實驗處理。細胞分組按1.2.2第2組，按相應方法處理ECA-109細胞24 h后收集細胞，制備單細胞懸液，參照文獻方法[11]，經消化、解旋、電泳后，Gel-red核酸染料染色，熒光顯微鏡下觀察細胞彗星形態，每個濃度制備3張片子，每張片子統計100個彗星樣細胞，通過CASP彗星圖像分析軟件分別計算彗星圖像的頭部DNA百分率、尾部DNA百分率、尾矩和Olive尾矩，本研究以Olive尾矩作為本實驗體系中評價細胞DNA損傷程度的指標。

1.3 統計學處理

應用SPSS13.0版軟件包處理數據，計量資料用（）的形式表示，行t檢驗，采用單因素方差分析比較各組間差異的顯著性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT實驗結果

采用MTT法比較兩種PARP抑制劑單獨或聯合HCPT對ECA-109細胞增值率的影響，見圖1。ECA-109細胞被處理24 h后，除1.0 μmol/L NU1025處理組（P＞0.05）外的所有NU1025和AG14361處理組細胞增殖率均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的NU1025對細胞增殖的抑制作用分別為5%和9%，明顯小于5.0 μmol/L（10%）和10.0 μmol/L（17%）的AG14361對細胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。MTT法比較兩種PARP抑制劑聯合HCPT對細胞增值率的影響，見圖2。

所有處理組（HCPT單獨處理組、HCPT+NU1025處理組和HCPT+AG14361處理組）細胞增殖率均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制劑聯合HCPT處理組細胞增殖率明顯低于HCPT單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中5.0 μmol/L和10.0 μmol/L NU1025聯合HCPT處理對ECA-109細胞增殖的抑制作用分別為29%和45%，明顯高于5.0 μmol/L（18%）和10.0 μmol/L（29%）的AG14361聯合HCPT處理，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 MTT試驗分析NU1025和AG14361處理24 h后ECA-109細胞增值率的變化。與對照組比較，*P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

圖2 MTT試驗分析HCPT聯合NU1025或AG14361處理24 h后ECA-109細胞凋亡率的變化。與對照組比較，*P＜0.05；與對HCPT處理組比較，#P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

2.2 流式細胞術檢測結果

通過流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙標法進一步分析了HCPT聯合NU1025或AG14361對ECA-109細胞凋亡的影響，見圖3。ECA-109細胞被處理24 h后，所有處理組（HCPT單獨處理組、HCPT+NU1025處理組和HCPT+AG14361處理組）細胞凋亡率均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制劑聯合HCPT處理組細胞增殖率明顯低于HCPT單獨處理組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；其中 5.0 μmol/L和 10.0 μmol/L NU1025聯合HCPT分別誘導了32%和44%的ECA-109細胞凋亡，明顯強于5.0 μmol/L（18%）和10.0 μmol/L（30%）的AG14361聯合HCPT處理，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 流式細胞術分析HCPT聯合NU1025或AG14361處理24 h后ECA-109細胞凋亡率的變化。與對照組比較，*P＜0.05；與HCPT處理組比較，#P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

2.3 彗星實驗檢測結果

為明確NU1025和AG14361是通過何種方式起到增敏作用，通過彗星實驗評價了HCPT聯合NU1025或AG14361處理后ECA-109細胞DNA損傷程度的影響，見圖4。ECA-109細胞被處理24 h后，所有處理組（HCPT單獨處理組、HCPT+NU1025處理組和HCPT+AG14361處理組）細胞DNA損傷水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制劑聯合HCPT處理組細胞DNA損傷程度明顯高于HCPT單獨處理組，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中5.0 μmol/L和10.0 μmol/L NU1025聯合HCPT對細胞DNA損傷的誘導作用明顯強于5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的AG14361聯合HCPT處理，前者分別為6.72和9.31，后者分別為5.34和6.91，前者相比與后者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 彗星實驗分析HCPT聯合NU1025或AG14361處理24 h后的ECA-109細胞DNA損傷程度變化。與對照組比較，*P＜0.05；與HCPT處理組比較，#P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

3 討論

NU1025和AG14361均為新型PARP抑制劑，前者在低毒劑量時可使3-甲基吲哚誘導人支氣管上皮細胞（NHBE）DNA損傷水平增加1倍，后者在低毒劑量時則可使拓撲替康誘導的人白血病細胞（K562） 凋亡水平上升3倍以上[11-12]。盡管如此，由于不同PARP抑制劑的選擇性不同，在不同細胞株或與不同化療藥物（或放療）聯用時表現出的增敏效果也有所不同，因此，在不同實驗體系中的具體應用仍需深入研究。

本研究以人食管癌細胞株ECA-109作為研究對象，探討NU1025和AG14361對HCPT誘導的細胞增殖和凋亡的影響。研究結果表明，NU1025和AG14361在單獨使用時，對ECA-109細胞增殖均起到了一定的抑制作用，且前者表現出較低的細胞毒性；但當NU1025和AG14361分別與HCPT聯用時，和AG14361相比，NU1025表現出了更強的增敏作用[13]。通過流式細胞術凋亡分析實驗證實NU1025和AG14361分別與HCPT聯用時，NU1025表現出了更強的增敏作用。研究結果表明，NU1025和AG14361分別與HCPT聯用時，在5.0～10.0 μmol/L時，二者均明顯加重了HCPT誘導的ECA-109細胞DNA損傷效應，相比于AG14361，NU1025對HCPT誘導的ECA-109細胞DNA損傷效應表現出了更強的促進作用。因此，結合MTT和細胞凋亡研究結果，說明在本研究體系中，NU1025和AG14361通過抑制PARP-1的活性，阻礙了PARP-1對HCPT誘導的DNA損傷的修復作用，進而促進了細胞凋亡，降低了細胞增值率，且NU1025表現出了更強的作用，相關分子機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明，在5.0～10.0 μmol/L時濃度范圍內的NU1025和AG14361均可顯著增強人食管癌細胞株ECA-109對HCPT的藥敏作用，且NU1025較AG14361具有更低的細胞毒性和更高的增敏作用的優勢，為今后食管癌的藥物治療研究提供了一個可能的治療靶點[14-15]。

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