尿毒癥患者外周Th17/Treg細胞變化與機體微炎癥狀態的關系*

劉璠娜， 董向楠， 胡 波， 管保章， 孟 宇， 馮艷艷， 尹良紅

(暨南大學附屬第一醫院腎內科，廣東廣州510632)

近來研究認為，尿毒癥不但是機體針對腎功能進行性衰竭所產生的一系列復雜的細胞、生物化學反應，同時還是一個以細胞因子驅動為特征的全身性慢性微炎癥狀態。微炎癥狀態導致患者免疫能力差，容易合并各種并發癥。輔助性T細胞17(T－helper 17 cells，Th17)是近年來發現的一類新型Th細胞亞群，其介導炎性反應，參與機體的免疫應答。調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)是能夠抑制免疫應答的重要細胞，具有抑制炎癥反應的作用，能夠下調免疫反應，從而降低對病原體的控制能力。Treg細胞和Th17細胞通過細胞因子的作用相互轉換，從而調節機體的免疫抑制與免疫效應并使之處于精細而復雜的動態平衡中［1］。Th17/Treg保持平衡，有利于機體免疫穩態的維持，如果Th17/Treg失平衡就會導致疾病發生乃至惡化。

維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid－related orphan receptor γt，RORγt)是核激素受體之一，是Th17細胞特異性轉錄因子［2－3］。叉頭框 P3蛋白(forkhead box P3 protein，Foxp3)特異性高表達于CD4+CD25+T細胞，是 Treg細胞特異性轉錄因子［4］，可反映 Treg細胞的活性水平。通過檢測Foxp3和RORγt mRNA的表達量，可以推斷Th17和Treg細胞水平的變化。因此，本研究擬通過對尿毒癥患者外周血Th17細胞和Treg細胞的分析，進一步探討尿毒癥中Th17細胞和Treg細胞的變化及其平衡在尿毒癥患者微炎癥狀態中的臨床意義。

材料和方法

1 研究對象

選擇2010年7月～2011年7月在我院診斷為尿毒癥的患者30例，男18例，女12例，平均年齡(53.0±5.7)歲，原發病為慢性腎炎及高血壓腎病，腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)＜15 mL/min;其中維持性血液透析(maintaining hemodialysis，MHD組)患者20例，未接受透析治療(chronic kidney disease，CKD組)10例。對照組(control組)20 例，男11 例，女9 例，平均年齡(45.0 ±5.7)歲，均為健康志愿者，無免疫相關性疾病，近期無感染及腎臟疾病。全部對象空腹抽取靜脈血，肝素抗凝，標本于采集后6 h內處理、分析。

2 方法

2.1 標本收集 各組患者均于清晨，空腹，平臥位，抽取靜脈血5～10 mL，分別裝于EDTA抗凝管和促凝管中。透析患者于透析前采血。

2.2 轉錄因子RORγt和Foxp3 mRNA的表達 上述標本與PBS緩沖液以1∶1比例混合后，小心加入1 mL的淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，并提取RNA，將溶解的RNA取2 μL于Take3板上，放于酶標儀中測A值(即260 nm與280 nm波長比值)，選取A值為1.8～2.0的RNA于－80℃備用。按一定比例配制反轉錄反應液，并在PCR儀上反轉錄。然后在NCBI上搜索RORγt和Foxp3對應的cDNA序列，用軟件Primer Premier 5分析引物，進行設計，然后將設計好的引物與NCBI中的BLAST中進行驗證，然后由英濰捷基(上海)貿易有限公司進行引物合成。引物序列為:

RORγt正義鏈 5'－ CCTGGGCTCCTCGCCTGACC－3'，反義鏈 5'－TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC －3';Foxp3正義鏈5'－CTGACCAAGGCTTCATCTGTG－3'，反義鏈 5'－ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC －3';β－actin正義鏈 5'－CACGAAACTACCTTCAACTCC－3'，反義鏈5'－CATACTCCTGCTTGCTGATC －3'。

然后稀釋引物，并進行PCR反應。將PCR產物與6×Buffer的緩沖液混勻后(比例為5∶1混勻)加入瓊脂糖凝膠內跑電泳，20 min后取出凝膠，在紫外觀察燈下觀察，GSM凝膠圖像分析管理系統拍照，Image－Pro Plus圖像處理系統對產物進行半定量分析。

2.3 血清細胞因子的測定 促凝管收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測白細胞介素－6(interleukin－6，IL－6)、IL－10和IL－17檢測步驟，使用全自動酶標儀讀取波長450 nm處的A值。通過繪制標準曲線求出標本中的IL－6、IL－10和IL－17的濃度。用免疫透射比濁法測定炎癥標志物高敏C反應蛋白(high－sensitivity C－reactive protein，hs－CRP)濃度。

3 統計學處理

結 果

1 轉錄因子RORγt和Foxp3的mRNA表達情況

RORγt與 Foxp3 mRNA分別是 Th17與Treg細胞特異性轉錄因子，通過其表達量可以推測出Th17與Treg細胞的含量。如表1所示，尿毒癥組與正常對照組相比，RORγt mRNA表達量較高，且有統計學意義(P＜0.05)。但是，CKD組與 MHD組相比，沒有統計學意義(P＞0.05)。相反，尿毒癥組與正常對照組相比，Foxp3 mRNA表達量低，差異有統計學意義(P＜0.05)。但CKD組與MHD組相比Foxp3表達量的差異無統計學意義。RORγt/Foxp3比值間接反應Th17/Treg細胞比例，由表1可以看出，與正常對照組相比，尿毒癥患者RORγt/Foxp3比值較高，且差異有統計學意義，而尿毒癥患者組，透析與未透析患者之間差異無統計學意義。

2 各組間胞因子的比較

IL－6、IL－17與hs－CRP含量在尿毒癥組較高，與正常對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2;而IL－10含量與正常對照組相比則較低，差異有統計學意義(P＜0.05)。IL－10、IL－17及 hs－CRP在CKD組的含量較MHD組低，差異有統計學意義(P＜0.05);而IL－6含量在CKD組和MHD組間無統計學意義。

表1 各組患者RORγt及Foxp3的表達及RORγt/Foxp3的比值Table 1.The expression of RORγt and Foxp3 and ratio of RORγt to Foxp3 in different groups(±s)

表1 各組患者RORγt及Foxp3的表達及RORγt/Foxp3的比值Table 1.The expression of RORγt and Foxp3 and ratio of RORγt to Foxp3 in different groups(±s)

*P ＜0.05 vs control group.

Group n RORγt/β －actin Foxp3/β －actin RORγt/Foxp3 Control 20 4.55 ±1.31 13.08 ±3.93 0.35 ±0.12 CKD 10 18.38 ±3.13* 7.96 ±2.24* 2.31 ±0.89*MHD 20 19.17 ±2.40* 8.54 ±3.35* 2.49 ±0.34*

表2 各組患者細胞因子濃度Table 2.The concentration of serum cytokines in different groups(±s)

表2 各組患者細胞因子濃度Table 2.The concentration of serum cytokines in different groups(±s)

*P ＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs MHD group

Group n IL－10(ng/L) IL－6(ng/L) IL－17(ng/L) hs－CRP(mg/L)Control 20 20.02 ±5.98 20.02 ±5.98 14.97 ±6.921.69 ±0.57 CKD 10 10.21 ±3.20* 27.56 ±7.27* 28.34 ±11.28* 3.28 ±1.24*MHD 20 12.14 ±4.21＊▲ 26.90 ±10.10* 31.92 ±15.29＊▲ 4.29 ±1.85＊▲

3 轉錄因子RORγt和Foxp3與細胞因子相關性

相關性分析顯示:hs－CRP水平隨RORγt/βactin增加而增加，且呈線性趨勢，Pearson相關系數r=0.776，P ＜0.05。而 hs－ CRP 水平隨 Foxp3/β －actin增加而減少，且呈線性趨勢，Pearson相關系數r= －0.685，P ＜0.05。

討 論

尿毒癥患者的微炎癥狀態不僅僅限于一般意義上的感染，是微觀層面上通過檢查血中的相關物質而明確的，具有持續性和間斷性的特點。炎癥反應可以引起機體行為、生理、生化及營養狀況等多方面的改變。在尿毒癥患者營養不良、炎癥、心腦血管動脈粥樣硬化等的一系列惡性循環中起著核心作用［5］。據文獻報道:透析人群中處于微炎癥狀態的患者可達30%～50%［6］。故及早發現處于微炎癥狀態的患者并對其進行提早干預治療是改善此類患者預后的一項極其必要的舉措。

Treg作為一種重要的免疫調節細胞，具有誘導免疫耐受，維持體內內環境穩定的作用。免疫抑制性是Treg細胞的最重要特性，能抑制效應性CD4+T細胞增生與活化［7］。Th17細胞介導炎性反應，參與機體的免疫應答［8］，Treg與Th17細胞保持平衡有利于機體免疫穩態的維持［9］。Th17細胞與Treg細胞之間的平衡狀態被打破是很多炎癥反應與自身免疫性疾病發生的關鍵因素［10］。

我們的研究表明，尿毒癥患者的RORγt/Foxp3的比值明顯高于健康志愿者，而CKD與MHD組無明顯差異。這說明在尿毒癥患者外周血中Th17細胞/Treg細胞比例增高，Treg細胞減少。由于Treg細胞下調，免疫抑制功能下降，導致效應性CD4+T細胞大量活化，產生大量致炎因子，導致透析患者免疫功能紊亂，Th17細胞數也隨之減少。Th17細胞表達水平過低，從而導致機體抵抗外來病原菌感染的能力下降，但Th17細胞過度表達可能引發炎性反應和自主免疫反應。提高尿毒癥患者外周血Treg的水平，將有助于改善該患者的免疫功能。

hs－CRP是反映微炎癥狀態的最敏感指標，hs－CRP超過正常即可確診為微炎癥狀態［11］。我們的研究表明:入選的尿毒癥患者存在微炎癥狀態，相關性分析發現 hs－CRP與 RORγt存在正相關，而與Foxp3存在負相關，并且能與hs－CRP共同反映患者體內是否存在微炎癥狀態的IL－10與IL－17也都出現相應的變化。反應Treg細胞的細胞因子IL－10明顯減低;而反應Th17細胞的細胞因子IL－17明顯增高。尿毒癥患者體內Th17細胞，IL－6和IL－17升高，而Treg細胞，IL－10降低，這可能是因為尿毒癥患者體內免疫平衡向促炎細胞方向傾斜，導致患者體內微炎癥狀態的進一步加劇。而微炎癥狀態中IL－6等促炎細胞因子也能使Treg細胞向Th17細胞轉化，更加劇了這兩種細胞發展的不平衡，引起了患者體內免疫功能的紊亂。這從另一個側面說明尿毒癥患者的微炎癥狀態與Treg細胞和Th17細胞的不平衡性相關。

綜上所述，Treg細胞與Th17細胞發展的不平衡性在尿毒癥患者的微炎癥狀態的發生發展中起重要作用。這種不平衡性一方面使免疫系統激活，另一方面免疫效應不足，這種雙向變化，進一步加劇了炎癥反應，加劇了患者微炎癥狀態的發展。這提示:抑制Th17細胞的活化并增強Treg細胞的活性，調節Th17細胞與Treg細胞的平衡，可以調節機體的免疫狀態，抑制微炎癥狀態的進展，從而為尿毒癥及維持性血液透析患者相關并發癥的治療提供了新的思路。

［1］Stummvoll GH，Dipaolo RJ，Huter EN，et al.Th1，Th2 and Th17 effector T cell－induced autoimmune gastritis differs in pathological pattern and in susceptibility to suppression by regulatory T cells［J］.J Immunol，2008，181(3):1908－1916.

［2］Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L，et al.The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL －17+T helper cells［J］.Cell，2006，126(6):1121－1133.

［3］Manel N，Unutmaz D，Littman DR.The differentiation of human TH－17 cells requires transforming growth factorβ and induction of the nuclear receptor RORγt［J］.Nat Immunol，2008，9(6):641 －649.

［4］Fontenot JD，Rasmussen JP，Williams LM，et al.Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor Foxp3［J］.Immunity，2005，22(3):329 －341.

［5］Bonello L，De Labriolle A，Roy P，et al.Impact of optimal medical therapy and revascularization on outcome of patients with chronic kidney disease and on dialysis who presented with acute coronary syndrome［J］.Am J Cardiol，2008，102(5):535 －540.

［6］Kaysen GA.The microinflammation state in uremia:cause and potential consequences［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12(7):1549－1557.

［7］Geiger TL，Tauro S.Nature and nurture in Foxp3(+)regulatory T cell development，stability，and function［J］.Hum Immunol，2012，73(3):232 －239.

［8］Waite JC，Skokos D.Th17 response and inflammatory autoimmune diseases［J］.Int J Inflam，2012，2012:819467.

［9］Zhang J，Hua G，Zhang X，et al.Regulatory T cells/T －helper cell 17 functional imbalance in uraemic patients on maintenance haemodialysis:A pivotal link between microinflammation and adverse cardiovascular events［J］.Nephrology，2010，15(1):33－41.

［10］吳鐵軍，張麗娜，亢翠翠.Treg/Th17失衡在膿毒癥發病機制中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(12):2411 －2413，2422.

［11］Kajitani N，Shikata K，Nakamura A，et al.Microinflammation is a common risk factor for progression of nephropathy and atherosclerosis in Japanese patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Res Clin Pract，2010，88(2):171 －176.