酵母雙雜交篩選與轉(zhuǎn)錄因子ZNF580相互作用的蛋白*

羅玉玉， 楊 蓉， 孔麟麟， 任黨麗， 張文成△

(1中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，天津300162;2武警沈陽(yáng)指揮學(xué)院門(mén)診部，遼寧沈陽(yáng)110034)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是缺血性心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)［1］，在我國(guó)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。AS是一種環(huán)境因素與遺傳因素共同作用而誘發(fā)的多基因病，深入研究與AS相關(guān)基因的功能及其參與AS發(fā)生的機(jī)制是心腦血管疾病研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

ZNF580是由本課題組以致動(dòng)脈粥樣硬化因素——低密度脂蛋白(low－density lipoprotein，LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系，篩選人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)，得到的一個(gè)新基因(Gen-Bank注冊(cè)號(hào):AF184939)。該基因編碼172個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。經(jīng)分子生物學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能分析顯示:其N(xiāo)端為脯氨酸富含域，C端含有3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，可能為C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員［2－3］。最新的研究表明:C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子可能是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制最重要的參與者，它們既可以結(jié)合DNA，又可以結(jié)合蛋白質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［4－6］。為了尋找可能與ZNF580存在相互作用的蛋白，及其可能參與的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終揭示ZNF580的功能，本研究擬采用酵母雙雜交技術(shù)釣取可能與ZNF580存在相互作用的蛋白。

材料和方法

1 菌株和質(zhì)粒

Y190酵母菌購(gòu)自Clontech;E.coli DH5α菌本室保存;酵母表達(dá)載體pGB－Vector購(gòu)自上海睿星基因公司;人胎腦cDNA文庫(kù)(載體為pACT2)購(gòu)自上海睿星基因公司;pEGFPC1－ZNF580本室保存。

2 主要試劑和試劑盒

營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基購(gòu)自Clontech;5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(5－bromo－4－chloro－3－indolyl β－D－galactoside，X－Gal)購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)公司;鮭魚(yú)精DNA購(gòu)自Sigma;SfiⅠ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)公司;T4 DNA連接酶購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)公司;高保真Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Promega;質(zhì)粒提取試劑盒(包括小量提取、大量制備2種)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Promega;PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Promega。

3 誘餌質(zhì)粒構(gòu)建

ZNF580擴(kuò)增:以pEGFP－C1－ZNF580為模版，生工合成的ZNF580特異性引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增(引物:5'－AAAAAGATCTTGCCCGGAGTGCGCCCGTG － 3'，3'－ AAAAAGCTTGTGGAGGCGCACGTGCTG－5')。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物過(guò)柱回收并酶切:反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。目的片段回收并與載體連接:反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。重組載體鑒定:重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)DH5α，涂卡那霉素陽(yáng)性平板37℃過(guò)夜。挑選7個(gè)單克隆搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用質(zhì)粒作模板PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，選擇其中2個(gè)樣品送TaKaRa測(cè)序。

4 誘餌蛋白自激活檢測(cè)

采用LiAC轉(zhuǎn)化法將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌Y190。檢測(cè)誘餌蛋白對(duì)LacZ報(bào)告基因是否存在轉(zhuǎn)錄激活作用。轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌如果表達(dá)β－半乳糖苷酶，則可使底物X－Gal變藍(lán)，說(shuō)明存在自激活，否則說(shuō)明無(wú)自激活。

5 酵母雙雜交篩選人胎腦文庫(kù)

5.1 人胎腦cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌 轉(zhuǎn)庫(kù)效率計(jì)算:轉(zhuǎn)庫(kù)效率只有達(dá)到1×107～1×108cfu/g DNA以上才能進(jìn)行文庫(kù)的篩選，以保證不會(huì)丟失陽(yáng)性克隆。對(duì)生長(zhǎng)在SD/－Trp/－Leu平板上的克隆計(jì)數(shù)，挑選克隆數(shù)在30～300之間的平板，根據(jù)稀釋度計(jì)算轉(zhuǎn)庫(kù)效率。

5.2 營(yíng)養(yǎng)缺陷平板初步篩選 人胎腦cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌，轉(zhuǎn)化方法同上(LiAC轉(zhuǎn)化法)。取200 μL菌液，涂布于150 mm SD/－Trp/－Leu/－His/+30 mmol/L 3－氨基 －1，2，4－三唑(3－amino－1，2，4－triazole，3－AT)平板上。第3 d起注意觀察平板酵母克隆生長(zhǎng)狀態(tài)。菌在SD/－Trp/－Leu/－His+30 mmol/L 3－AT平板上生長(zhǎng)7～14 d后，會(huì)有陽(yáng)性克隆長(zhǎng)出，陽(yáng)性克隆一般大于3 mm。

5.3 β－半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選 上述克隆全部進(jìn)行β－半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)，變藍(lán)色的為陽(yáng)性克隆。

5.4 一對(duì)一驗(yàn)證 隨機(jī)挑取部分陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，一對(duì)一轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌驗(yàn)證，陽(yáng)性者抽提質(zhì)粒送TaKaRa測(cè)序。

6 生物信息學(xué)分析

利用 NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb i.nlm.nih.gov)對(duì)返回的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒

成功將ZNF580全長(zhǎng)編碼序列構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGB上，見(jiàn)圖1～4，說(shuō)明pGB－ZNF580構(gòu)建成功。

2 誘餌蛋白自激活檢測(cè)

轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌落未變藍(lán)，轉(zhuǎn)化了陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的酵母菌落變藍(lán)，說(shuō)明誘餌蛋白無(wú)自激活。可以進(jìn)行下一步的篩庫(kù)工作，見(jiàn)圖5。

Figure 1.ZNF580 PCR product electrophoresis.圖1 ZNF580 PCR產(chǎn)物電泳

Figure 2.ZNF580 PCR product electrophoresis after restriction enzyme digestion.圖2 ZNF580 PCR產(chǎn)物酶切后電泳

Figure 3.The recombinant plasmid pGB－ZNF580 verified by PCR.M:marker;Lane1～7:PCR products.圖3 重組質(zhì)粒pGB－ZNF580 PCR鑒定

Figure 4.The recombinant plasmid pGB－ZNF580 verified by restriction enzyme digestion.Lane 1 and 2:digestion products.圖4 重組質(zhì)粒pGB－ZNF580酶切鑒定

Figure 5.Bait protein self－autoactivation assay.Left:the colonies of Y190 transformed with pCL1(positive control)turned blue after 2 h，which means the activation of lacZ reporter.Right:the colonies of Y190 transformed with pGB－ZNF580 didn't turn blue，which means the bait proteins had no self－autoactivation and could be used in library screening.圖5 誘餌蛋白自激活檢測(cè)

Figure 6.Thirty－five positive colonies identified by β －galactosidase colony－lift filter assay in yeast two－h(huán)ybrid screening.圖6 35個(gè)陽(yáng)性克隆

3 人胎腦cDNA文庫(kù)篩選

首先在營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上初步篩選，共獲得169個(gè)陽(yáng)性克隆，此時(shí)的1個(gè)酵母克隆可能含有2種或2種以上的文庫(kù)質(zhì)粒，把全部169個(gè)克隆分別在－Trp－Leu平板上劃線(xiàn)分離單克隆后，再挑取單克隆在－Trp－Leu－His平板上培養(yǎng)，把培養(yǎng)板上的克隆全部進(jìn)行β－半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選獲得136個(gè)陽(yáng)性克隆。隨機(jī)挑選其中40個(gè)陽(yáng)性克隆從酵母中提取質(zhì)粒，再把得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中再次用氨芐西林抗性篩選，從中再次提取質(zhì)粒，這樣我們就獲得了文庫(kù)質(zhì)粒，把獲得的文庫(kù)質(zhì)粒一對(duì)一單獨(dú)轉(zhuǎn)入誘餌酵母細(xì)胞中，進(jìn)行重復(fù)鑒定。只有轉(zhuǎn)化了分離所得文庫(kù)質(zhì)粒后變藍(lán)，轉(zhuǎn)化了空載體后不變藍(lán)的確認(rèn)為最后的陽(yáng)性克隆，最終獲得35個(gè)陽(yáng)性克隆，見(jiàn)圖6，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序分析。

4 生物信息學(xué)分析

對(duì)35個(gè)陽(yáng)性克隆相應(yīng)的AD質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，其中1個(gè)沒(méi)有測(cè)出信號(hào)。對(duì)其余34個(gè)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，這些序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中是14種不同的基因。編碼14種已知蛋白。其中有2種基因含有完整的編碼序列，分別為SH3－domain GRB2－like 3(SH3GL3)和 D4，zinc and double PHD fingers family 1(DPF1);有12種基因含有部分編碼區(qū)，分別為:activity－dependent neuroprotective protein(ADNP)、Smad family member 2(SMAD2)、glyoxalase domain containing 4(GLOD4)、kinesin family member 3A(KIF3A)、kinesin － associated protein 3(KIFAP3)、phospholipase A2－ activating protein(PLAA)、phospholipase C gamma 1(PLCG1)、XPA binding protein 2(XAB2)、tripartite motif－ containing 32(TRIM32)、suppressor of Ty16 homolog(SUPT16H)、Wilms tumor 1 interacting protein(WTIP)和 DIP2 disco－interacting protein 2 homolog C(DIP2C)。在這些序列中有部分重復(fù)，為同一個(gè)基因的相同或不同片段。

討 論

本研究應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫(kù)，最終獲得了14種可能與ZNF580存在相互作用的蛋白，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)獲得了它們的功能信息。這里我們重點(diǎn)討論ZNF580與其中一種蛋白——磷脂酶C的相互作用關(guān)系。

磷脂酶C(phospholipase C，PLC)是普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的磷脂酰肌醇信號(hào)通路的關(guān)鍵酶。目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定出12種PLC同工酶，根據(jù)其不同的氨基酸序列分為5型:PLC－β、PLC－γ、PLC－δ、PLC－ε和 PLC－ξ。許多細(xì)胞外信號(hào)分子，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫球蛋白、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等都可以激活磷脂酰肌醇特異性PLC。進(jìn)而將信息傳遞給下游效應(yīng)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，PLC－γ1不僅具有催化分解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的脂酶功能，而且也具有蛋白接合器的作用，PLC－γ1分子除了由X和Y區(qū)構(gòu)成的酶活性部位外，還有作為蛋白質(zhì)相互結(jié)合的SH(Src homology domain)區(qū)，為2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域。通過(guò)這些結(jié)構(gòu)區(qū)域與其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子結(jié)合，產(chǎn)生多種細(xì)胞反應(yīng)［8－9］。目前已知的可以和 PLC－γ1相互作用的蛋白有 Rac1、PLD2、Grb2、Akt等［10－12］。

PLC－γ1是許多能自身磷酸化的生長(zhǎng)因子受體作用的底物。如血小板生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素生長(zhǎng)因子等［13］。PLC－γ1的活化主要通過(guò)蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)途徑。多種生長(zhǎng)因子與具有內(nèi)源性PTK活性的受體型PTK結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化，導(dǎo)致受體內(nèi)在的PTK激活，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化，產(chǎn)生對(duì)PLC－γ1具有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，活化的PTK能特異性地識(shí)別PLC－γ1的SH2結(jié)構(gòu)域，并將蛋白質(zhì)序列中的酪氨酸磷酸化，從而激活PLC－γ1。激活的PLC－γ1水解PIP2產(chǎn)生二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，DAG能激活蛋白激酶C，IP3能引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放，通過(guò)這兩條通路或者和其它未知通路形成廣泛的crosstalk，從而啟動(dòng)多種細(xì)胞反應(yīng)，影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等功能［14］。

本課題組前期對(duì)ZNF580蛋白分子進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明:ZNF580蛋白分子上存在一系列的蛋白酶磷酸化作用位點(diǎn)，其中141～143位THR氨基酸為蛋白激酶C磷酸化作用位點(diǎn);130～133位KRSS氨基酸為cAMP及cGMP依賴(lài)型蛋白激酶磷酸化作用位點(diǎn)。可以推測(cè)，ZNF580在細(xì)胞內(nèi)作為核轉(zhuǎn)錄因子的活性受磷酸化作用的調(diào)節(jié)。如果ZNF580與PLC－γ1之間存在相互作用，那么ZNF580很可能參與PTK途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其可能的信號(hào)通路見(jiàn)圖7。

Figure 7.The possible mechanism of ZNF580 involved in protein tyrosine kinase(PTK)signal pathway.PLC:phospholipase C;PIP2:phosphatidylinositol biphosphate;IP3:inositol triphosphate;DAG:diacylglycerol;PKC:protein kinase C.圖7 ZNF580參與PTK信號(hào)通路的可能機(jī)制

但是關(guān)于ZNF580參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其功能的研究目前仍然處于起步階段，而且由于蛋白質(zhì)分子間的相互作用非常復(fù)雜，時(shí)空特異性等方面的偏差會(huì)導(dǎo)致一些人為的假象。酵母細(xì)胞是最簡(jiǎn)單的真核細(xì)胞，其體內(nèi)蛋白質(zhì)合成后加工修飾類(lèi)型及其程度與哺乳動(dòng)物的相應(yīng)過(guò)程存在一定差別，因此酵母雙雜交的結(jié)果僅僅是初步提出相互作用的可能性，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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