近紅外熒光量子點表皮生長因子受體單克隆抗體探針對頭頸部鱗狀細胞癌活體可視化成像和體內分布的動物實驗研究

[摘要] 目的 探討近紅外熒光量子點（QDs）表皮生長因子受體（EGFR）單克隆抗體（mAb）探針對頭頸部鱗狀細胞癌的原位可視化成像和體內分布情況。方法 將發射波長為800 nm的近紅外熒光QDs與EGFR mAb連接，制備QD800-EGFR mAb探針。在體外將QD800-EGFR mAb與人頰鱗狀細胞癌BcaCD885細胞共培養30 min，使用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察QD800-EGFR mAb對BcaCD885細胞的結合情況。將QD800-EGFR mAb通過尾靜脈注射到裸鼠頭頸部鱗狀細胞癌模型，在不同時間點通過活體成像觀察QD800-EGFR mAb對頭頸部鱗狀細胞癌的可視化成像情況和QD800-EGFR mAb在體內的分布。結果 靜脈注射QD800-EGFR mAb探針后能對裸鼠頭頸部鱗狀細胞癌進行清楚的可視化熒光成像，成像一直持續到24 h，但在30 min～6 h時間段內腫瘤成像最完整和熒光信噪比最高。對體內QD800-EGFR mAb在腫瘤和器官的分布檢測證明：QD800在肝中分布最多，在腫瘤中的聚集隨著時間的延長逐漸下降，心、腦、腸、肺、胃中均未見有QD800。結論 QD800-EGFR mAb探針對頭頸部癌能進行清楚的可視化個體成像檢測，在非侵入可視化成像研究頭頸部癌的發生發展和個體化治療等方面有巨大的發展前景。

[關鍵詞] 頭頸癌； 量子點； 表皮生長因子受體； 成像； 體內分布

[中圖分類號] R 739.8 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.003

對活體內癌細胞可視化實時成像觀察在研究癌癥的發生發展和個體化治療中具有重要作用，同時也是抗癌領域里研究的難點和熱點。近年來發展起來的量子點（quantum dots，QDs）在該領域顯示出巨

大的發展前景[1-2]。

QDs是一種由Ⅱ～Ⅵ族元素或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的納米微晶體，與目前傳統的有機熒光染料和熒光蛋白相比，QDs具有如下獨特的光學特性：QDs激發光譜寬且連續分布，發射光譜窄而對稱，熒光度強，光化學穩定性好，不易發生光漂白，通過改變粒子的尺寸和組成可獲得從紫外到近紅外范圍內任意點的光譜[1-3]。QDs的這些光學特征是目前所有熒光探

針都不具備的。特別是近年來發展起來的發射波長在700～900 nm范圍內的近紅外熒光量子點（near-infrared fluorescent quantum dots，NIRF-QDs），其不僅可以避免組織自發熒光（400～600 nm）的干擾，同時對組織具有強的穿透力，因而特別適合于體內可視化成像研究[4-5]。

目前研究表明：頭頸部鱗狀細胞癌細胞高表達表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，

EGFR）[6-7]。本研究將人頰鱗狀細胞癌BcaCD885細胞植入裸鼠的頦-頸交界部皮下，建立頦-頸部鱗癌模型，用最大發射波長為800 nm的QDs與EGFR單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）連接，制備QD800-EGFR mAb探針，通過靜脈注射QD800-EGFR mAb對頭頸部鱗狀細胞癌進行原位可視化成像觀察，并觀察其體內分布特征，為進一步探索基于抗體靶向性的NIRF-QDs對頭頸部鱗狀細胞癌的可視化成像和個體化診治提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑和儀器 QD800抗體偶聯試劑盒（Invitro-

gen公司，美國），EGFR mAb（Abcam公司，英國），人頰鱗狀細胞癌細胞株BcaCD885（四川大學口腔疾

病研究國家重點實驗室），紫外分光光度計（DU600，Beckman公司，美國），冷凍離心機（Z233MK-2，

HERMLE公司，德國），激光掃描共聚焦顯微鏡（la-ser scanning confocal microscope，LSCM）（TCS-SP5，Leica公司，德國），Maestro活體成像系統（Maestro EX，Cri公司，美國）。

1.1.2 實驗動物 選取重慶醫科大學實驗動物中心提供的SPF級BALB/c nu/nu裸鼠12只為研究對象，鼠齡6～8周，體重20～25 g。恒溫恒濕條件下飼養，墊料、飼料和飲水均經滅菌處理。所有實驗操作程序均經過重慶醫科大學實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 QD800-EGFR mAb探針的制備和純化 根據QD800抗體偶聯試劑盒中實驗手冊所提供的實驗步

驟來進行QD800-EGFR mAb探針的制備，本實驗分為4步，具體如下。1）QDs的活化和洗脫：將濃度為

10 mmol·L-1的雙功能SMCC溶液14 μL以及濃度為

4 μmol·L-1的QD800液125 μL混合，在室溫下活化1 h后用脫鹽柱洗脫，收集有色洗脫液500 μL備用。2）抗體還原和分離：將濃度為1 mol·L-1的二硫蘇糖醇液體6.1 μL加入到300 μL濃度為1 mg·mL-1的EGFR單抗PBS液中，室溫下還原反應30 min后加入染料指示液，用脫鹽柱洗脫，收集著色液500 μL備用。3）偶聯和滅活：將收集的以上兩種洗脫液混合，室溫下偶聯反應1 h后加入3 μL濃度為10 mmol·L-1的2-巰基乙醇，室溫下滅活反應30 min。4）濃縮和純化：將以上偶聯滅活后的液體加入超濾裝置管中7 000 r·min-1離心15 min，收集超濾離心膜內側偶聯溶液，然后用Pierce柱行色譜分離，得純化的QD800-EGFR mAb探針。最后根據產品說明書提供的消光系數和測量波長兩個參數，以及以此波長作為激發光在紫外分光光度計中測出相對應的吸光度和比色杯的光程，計算出QD800-EGFR mAb探針的濃度。計算公式為：A=εcl，其中A為吸光度值，ε為消光系數，c為分子濃度，l為光程。

1.2.2 QD800-EGFR mAb探針體外標記BcaCD885活細胞 將生長良好的BcaCD885細胞以每毫升5×104個的濃度接種到9個35 mm玻璃底培養皿（直徑為15 mm）中，每個1 mL，培養24 h后，棄去培養基，PBS清洗3次。然后分為3組，每組3個培養皿。實驗組加入濃度為100 nmol·L-1的QD800-EGFR mAb探針100 μL；對照組Ⅰ加入100 μL濃度為100 nmol·L-1的QD800；對照組Ⅱ先加入濃度為1 μg·mL-1的EGFR mAb 200 μL以封閉EGFR，2 h后用PBS清洗3次，然后加入濃度為100 nmol·L-1的QD800-EGFR mAb探針100 μL。以上各組在37 ℃下孵育30 min后用PBS沖洗3次，然后在LSCM下觀察QD800-EGFR mAb探針標記BcaCD885細胞的情況。

1.2.3 裸鼠頭頸鱗狀細胞癌模型的建立 取對數生長期的BcaCD885細胞，采用0.5%胰蛋白酶進行消化，在4 ℃下，800 r·min-1離心4 min，然后將BcaCD885細胞懸于PBS液中，將含有2×106個BcaCD885細胞的PBS懸液0.2 mL注射于12只裸鼠的頦-頸交界部皮下，從而建立了頭頸部鱗狀細胞癌模型，每日觀察腫瘤的生長情況，待腫瘤的最大徑達到0.8～1.0 cm時開始實驗。

1.2.4 腫瘤活體可視化成像觀察 將頭頸部鱗狀細胞癌模型裸鼠分為實驗組和對照組，每組6只，用2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）行腹腔注射麻醉后，實驗組通過尾靜脈注射100 μL的QD800-EGFR mAb探針

（含100 pmol當量的QD800）。對照組通過尾靜脈注射250 μL濃度為1 mg·mL-1的EGFR mAb，24 h后再注射100 pmol當量的QD800-EGFR mAb探針100 μL。所

有動物于注射QD800-EGFR mAb探針之后15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、9 h、24 h的7個不同時間點用Maestro活體成像系統進行可視化成像檢測，激發光/發射光為630 nm/800 nm，曝光時間為50 ms，像素為1 024×1 024。將采集的圖像用Maestro 2.10.0軟件進行處理和數據分析，分別顯示自發熒光和目標熒光信號，然后測量其熒光值，并且計算熒光信噪比，即腫瘤熒光強度與背景自發熒光強度之比。將每種信號添加偽色彩，本研究將自發熒光設置為綠色，目標熒光信號設置為紅色，最后將兩種色彩相疊加。

1.2.5 QD800-EGFR mAb熒光探針的體內分布和器官的組織檢查 實驗組和對照組分別在3 h成像完畢后斷頸處死裸鼠3只，24 h成像后處死裸鼠3只，解剖取出裸鼠的腫瘤、心、肝、脾、肺、左腎、右腎、腦、腸、胃，各器官用PBS沖洗后切分為2塊，一塊器官組織稱重后剪成小碎片，放入玻璃勻漿器內勻漿，取各器官勻漿液100 μL放入96孔培養板內，用Maestro活體成像系統進行成像，根據各器官勻漿液的平均熒光和各器官重量對各器官內QD800熒光行半定量分析。同時將各器官另一塊組織用冰凍切片包埋劑包埋并速凍，在-20 ℃下連續切割為7 μm厚的組織切片，每兩張連續的冰凍切片中，一張行常規HE染色，另一張冰凍組織切片在LSCM下觀察QD800在組織中的分布情況。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行分析，實驗結果以x±s表示，對兩均數間比較采用t檢驗，對3個均數以上間的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QD800-EGFR mAb探針的制備和純化

收集純化的QD800-EGFR mAb探針樣本，按照產品說明書上提供的在550 nm下的消光系數ε550=1.7×106（mol·L-1）-1cm-1，以及在550 nm下測得的A為

3.442，l=1 cm，計算得到最終純化的QD800-EGFR mAb探針濃度為2.025 μmol·L-1。

2.2 QD800-EGFR mAb探針體外標記BcaCD885活

細胞

在LSCM下，實驗組BcaCD885細胞膜上可見明顯的QD800紅色熒光，對照組Ⅰ和對照組Ⅱ的BcaCD885細胞均未觀察到QD800的熒光（圖1）。

2.3 腫瘤活體可視化成像

裸鼠頦-頸交界處皮下接種BcaCD885細胞1周后即可見明顯的腫瘤生長，12只裸鼠全部成瘤。3周后腫瘤最大直徑達到0.8～1.0 cm時開始實驗。實驗組在尾靜脈注射QD800-EGFR mAb探針15 min后腫瘤部位出現明顯的熒光信號，30 min～6 h時腫瘤的熒光信號最完整，與腫瘤大小對應，在9 h時觀察到腫瘤的熒光成像明顯變小，24 h時只有很小的熒光成像（圖2）。30 min～6 h時實驗組熒光信噪比較高，9 h時熒光信噪比明顯降低，24 h時熒光信噪比接近基線水平（圖3）。對照組只在15 min時腫瘤部位可檢測到微弱熒光信號，可能是BcaCD885癌細胞對QD800-EGFR mAb非特異性吞噬所導致，但30 min～24 h時未檢測到明顯區別于背景熒光的熒光信號（圖2、3）。實驗組和對照組裸鼠肝脾相對應的部位在靜脈注射QD800-EGFR mAb探針后15 min可見明顯的熒光信號，一直持續到24 h（圖2）。

2.4 QD800-EGFR mAb探針的體內分布和器官的組

織檢查

在3 h和24 h實驗組和對照組成像完畢后，在光鏡下觀察腫瘤的HE染色切片均可見大量癌細胞，顯示腫瘤生長良好（圖4）。在LSCM下觀察腫瘤和各器官的冰凍組織切片可見：3 h時實驗組和對照組的肝、脾組織以及實驗組腫瘤中均有大量QD800聚集，左右腎組織中可見有散在QD800。在24 h時實驗組和對照組的肝、脾組織中有大量QD800聚集，左右腎組

織和實驗組腫瘤中可見有散在QD800（圖5）。在3 h和24 h時實驗組和對照組的心、腦、腸、肺、胃和對照組腫瘤中均未見有明顯的QD800（圖5）。

cinoma

在3 h和24 h各器官組織勻漿的熒光半定量分析結果見圖6。由圖6可見，在3 h和24 h時實驗組和對照組肝中QD800的平均熒光均最高，顯著高于其他器官（P<0.05），其次是實驗組腫瘤和脾。在3 h和24 h時實驗組中腫瘤平均熒光均顯著高于對照組（P<0.05），實驗組中腫瘤平均熒光在3 h時顯著高于24 h時的平均熒光（P=0.042 3）。在3 h和24 h時其他各器官的平

均熒光在實驗組和對照組中差異無統計學意義（P>

0.05）。

3 討論

目前對癌癥成像檢測較好的方法如CT、MRI等傳統方法均不適合臨床醫師在術中對癌細胞進行實時可視化檢查。近年來基于納米技術發展起來的NIRF-QDs在對體內癌細胞的直接可視化成像檢測顯示出巨大的發展前景[1-5]。表面生物功能化的QDs標記活

細胞后，在實驗檢測所需濃度范圍內對細胞沒有毒性，不影響活細胞的生長、增殖、凋亡和分化[3，8-10]。由于NIRF-QDs具有獨特的光學性質，同時QDs作為納米粒還具有易于表面修飾連接和易于穿透腫瘤新生血管到達癌細胞的性質，因此，QDs在癌癥個體化手術治療方面顯示出獨一無二的優勢[3-10]。

本研究體外結果表明：QD800不能與BcaCD885細胞結合，QD800-EGFR mAb探針能與BcaCD885細胞結合，但不能夠與被EGFR mAb封閉EGFR后的BcaCD885細胞結合，這就證明了mAb與QD800連接后，EGFR mAb的免疫活性沒有改變，QD800-EGFR mAb探針能通過特異性免疫識別BcaCD885細胞表達

的EGFR，從而使QD800結合到細胞表面。

筆者選擇高表達EGFR的BcaCD885細胞移植于頭頸部進行活體可視化成像研究，主要是因為：1）納米粒QDs進入血液后易被體內的單核吞噬系統細胞作為異物識別而吞噬，從而大量聚集于含單核吞噬系統細胞豐富的肝脾等器官，這對軀體部腫瘤的成像產生很大的干擾，但對頭頸部的成像無干擾，因此頭頸部是QDs可視化成像較理想的部位；2）各種靶向性探針經靜脈注射后對腫瘤的靶向性本身與腫瘤的生長部位也密切相關；3）頭頸部惡性腫瘤大多為鱗狀細胞癌，而90%以上的頭頸部鱗狀細胞癌細胞高表達EGFR[6-7]，以EGFR為靶點用QDs進行可視化

成像對頭頸部鱗狀細胞癌具有廣泛的適用性。

本研究基于頭頸部鱗狀細胞癌高表達EGFR為靶點，用靜脈途徑注射QD800-EGFR mAb探針，檢查表明：QD800-EGFR mAb在體內能通過EGFR mAb作為橋梁對表達EGFR的BcaCD885細胞靶向結合，即QD800的熒光能代表BcaCD885細胞的存在，QD800與細胞結合后的熒光在體外能夠清楚可見。本研究中在注射QD800-EGFR mAb探針15 min后能夠看到清楚的成像，但在30 min能檢測到較15 min熒光度更高和更完整的腫瘤成像，這種高熒光度能完整顯示腫瘤的成像，但是30 min～6 h無明顯變化，在9 h時腫瘤成像明顯變小，熒光度也明顯減低，提示用QD800-EGFR mAb探針行頭頸部鱗狀細胞癌個體化成像檢測的最佳時間為靜脈注射QD800-EGFR mAb探針后30 min～6 h這一時間段內，隨著時間的推移，在24 h時腫瘤成像進一步變小，熒光度也更低。

前期研究也表明：在皮膚屏障存在的情況下，QD800標記癌細胞后能可視化成像檢測到104個癌細胞，比目前的CT和MRI對最小癌灶檢測的敏感性提高了100倍，但如果在實際手術中，由于腫瘤暴露在開放的創面下，其檢測的敏感性將會進一步提高[11]。Gao等[12]預測NIRF-QDs標記癌細胞后能可視化檢測

到10～100個細胞的水平。隨著更高質量、更強組織穿透力QDs的合成和光學成像技術的不斷發展，在暴露的創面下QDs對癌細胞的可視化成像檢測有望達到單個細胞水平，以后臨床醫師只需佩帶一個很小的激發光源探頭和近紅外光接受器，就可在手術中對腫瘤進行真正“量體裁衣”的個體化手術切除。

目前對QD800-EGFR mAb探針進入體內后的代謝過程還不清楚，本研究結果可見：靜脈注射QD800-EGFR mAb探針后15 min～24 h，肝脾相應部位均顯示出清楚的成像，提示肝、脾內一直有大量QD800聚集。在注射QD800-EGFR mAb探針3 h和24 h后，QD800在肝、脾組織中分布最多，其次是腎，而心、腦、腸、肺、胃和對照組腫瘤中均未見有明顯QD800分布，但在3 h時實驗組腫瘤中QD800顯著高于24 h時。

本研究結果表明：QD800-EGFR mAb探針靜脈注射后對高表達EGFR的頭頸鱗狀細胞癌能進行清楚的可視化個體成像檢測，在非侵入可視化成像研究頭頸鱗狀細胞癌的發生發展和個體化治療等方面有著巨大的發展前景。但QD800-EGFR mAb探針進入體內后在肝、脾組織中大量聚集。如何減少QD800-EGFR mAb探針進入體內后在肝、脾組織中聚集，以及研究如何代謝和清除是今后研究的重要方向。

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（本文編輯 杜冰）