p38絲裂素活化蛋白激酶信號通路在應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞分化中的作用

[摘要] 目的 研究在C2C12細(xì)胞成肌分化過程中應(yīng)力對絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路中p38絲裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路的影響。方法 將6孔Bio Flex培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞，以0.5 Hz的加載頻率和10%的細(xì)胞拉伸變形幅度，分別進(jìn)行拉伸培養(yǎng)2、6、12、24 h，應(yīng)用Western blot免疫印跡檢測總p38和磷酸化p-p38（Thr180/Tyr182）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 周期性機(jī)械拉伸在調(diào)控C2C12成肌細(xì)胞分化過程中，p38MAPK信號通路

被激活。p38MAPK信號通路蛋白磷酸化水平在較高水平；而p38MAPK通路總蛋白表達(dá)維持在一基線水平，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。加入p38MAPK信號通路特異性抑制劑SB203580后再加力，Myogenin的表達(dá)明顯降低。結(jié)論 p38MAPK信號通路在應(yīng)力介導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，但不是這一調(diào)控過程的唯一通路。

[關(guān)鍵詞] p38絲裂素活化蛋白激酶； 分化； 成肌細(xì)胞

[中圖分類號] Q 257 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.004

在骨骼肌的發(fā)育過程中，成肌細(xì)胞發(fā)生兩方面的成肌變化，一方面是成肌細(xì)胞增生；另一方面是增生的成肌細(xì)胞分化。成肌細(xì)胞的增殖和分化不僅是發(fā)育中形態(tài)構(gòu)建的重要機(jī)制，也是成體形態(tài)維持的重要機(jī)制，這兩者都受外界信號的調(diào)節(jié)。其中力學(xué)信號是骨骼肌形成和再生的重要外界因子[1-2]。但成肌細(xì)胞如何感知力學(xué)信號，從而特異性地激活其信號轉(zhuǎn)

導(dǎo)途徑，影響調(diào)控成肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory

factors，MRFs）的表達(dá)，對肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的潛能發(fā)揮效應(yīng)，目前還不得而知。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一。到目前為止，在真核生物細(xì)胞中已明確了5條MAPKs通路，分別為細(xì)

胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated

protein kinase，ERK）通路、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38絲裂素活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated

protein kinase，ERK）3/4和ERK5亞家族。研究發(fā)現(xiàn)：p38MAPK能被多種細(xì)胞外的刺激因素激活，包括機(jī)械壓力、炎癥性細(xì)胞因子及生長因子等[3-4]。p38MAPK是p38MAPK通路中的核心蛋白，它的活性受其上游絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein

kinase kinase，MAPKK）的調(diào)控。MAPKK通過磷酸化p38MAPK蛋白Thr-Gly-Tyr（TGY）位點(diǎn)中的蘇氨酸和酪氨酸使其活化，活化的p38MAPK進(jìn)一步磷酸化下游的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控p38MAPK信號通路。本實(shí)驗(yàn)旨在研究在應(yīng)力介導(dǎo)的C2C12細(xì)胞成肌分化過程中，應(yīng)力對MAPKs信號通路中p38MAPK信號通路的影響；并通過觀察p38MAPK信號通路特異性抑制劑SB203580對C2C12細(xì)胞成肌分化的影響，進(jìn)一步明確p38MAPK通路在應(yīng)力誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成肌分化中的作用，為闡明應(yīng)力誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C2C12小鼠成肌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），胰酶-乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）（北京Solarbio公司），SB203580（Sigma公司，美國），p-p38（Thr180/Tyr182）antibody、p38

antibody（Cell signaling公司，美國），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、Myogenin/β-actin（Santa Cruz公司，美國），6孔Bio Flex特制細(xì)胞培養(yǎng)皿（Flexcell公司，美國），多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)（哈爾濱工業(yè)大學(xué)研制），

Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD Gel Doc2000，Bio-rad公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 C2C12小鼠成肌細(xì)胞力刺激培養(yǎng)模型的建立

取傳至第3代生長良好的C2C12小鼠成肌細(xì)胞，胰酶消化后吹散，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整濃度至每毫升5×104個，接種于6孔Bio Flex特制細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)板上細(xì)胞貼壁培養(yǎng)48 h后，將生長培養(yǎng)基換為分化培養(yǎng)基，在分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1 d，以促進(jìn)細(xì)胞分化，讓細(xì)胞充分融合（細(xì)胞融合接近85%），并同步化，避免細(xì)胞融合

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。然后在無菌條件下，將培養(yǎng)皿與多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)連接，對衛(wèi)星細(xì)胞施加不同時間的張應(yīng)變刺激。各加力組每天分別對待測細(xì)胞加載2、6、12、24 h的張應(yīng)力和壓縮力，力值為10%，頻率為0.5 Hz。對照組放在同一孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，不進(jìn)行離心加力，其余條件相同。實(shí)驗(yàn)組與對照組同時種板，各重復(fù)3次。

1.2.2 阻斷劑預(yù)處理及細(xì)胞加載方案 為進(jìn)一步明確p38MAPK信號通路在C2C12成肌細(xì)胞分化中的作用，將p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580加入實(shí)驗(yàn)組，按說明書的要求將阻斷劑稀釋為20 μmol·L-1，保存待用。在6孔Bio Flex培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)48 h并同步化后，換用含有阻斷劑的DMEM培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后以0.5 Hz的加載頻率和10%的細(xì)胞拉伸變形幅度進(jìn)行拉伸培養(yǎng)24 h。對照組放在同一孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，不進(jìn)行離心加力，其余條件相同。各組重復(fù)3次，加力結(jié)束后分別收獲細(xì)胞。

1.2.3 Western blot免疫印跡檢測p38MAPK信號通路蛋白表達(dá)水平 按蛋白提取試劑盒裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白定量，按每孔10 μg·L-1蛋白量上樣，電泳

2 h后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，以50 g·L-1脫脂牛奶/TBST封閉1 h。將孵育磷酸化一抗p-p38（1∶1 000）顯色曝光過的PVDF膜置于抗體洗脫液中，50 ℃下?lián)u床振搖60 min；TBST洗滌10 min×3；重新加入總蛋白一抗p38（1∶1 000）孵育，余步驟同前。同上方法準(zhǔn)備HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫孵育，余步驟同前。

1.2.4 Western blot免疫印跡檢測周期性張應(yīng)力以及p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580對成肌素（Myogenin）蛋白表達(dá)水平的影響 按蛋白提取試劑

盒裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白定量，按每孔10 μg·L-1蛋白量上樣，電泳2 h后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以50 g·L-1脫脂牛奶/TBST封閉1 h。將孵育磷酸化一抗Myogenin（1∶1 000）顯色曝光過的PVDF膜置于抗體洗脫液中，50 ℃下?lián)u床振搖60 min；TBST洗滌10 min×3；重新加入總蛋白一抗β-actin（1∶1 000）孵育，余步驟同前。同上方法準(zhǔn)備HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫孵育，余步驟同前。

1.2.5 主要觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)：1）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；2）采集p-p38及p38免疫印跡圖分別記為Ap-p38、Ap38，p38的磷酸化程度用Ap-p38/Ap38，即磷酸化與總蛋白條帶灰度分析比值表示；3）Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)采集Myogenin及β-actin蛋白免疫印跡圖像，Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，分別記為AMyogenin、Aβ-actin，目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值A(chǔ)Myogenin/Aβ-actin表

示Myogenin相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每一樣本重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，對Western blot免疫印跡數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

在倒置熒光顯微鏡下觀察可見，對照組細(xì)胞為長梭形，呈無序排列。而加載后2 h和6 h，相比對照組細(xì)胞排列規(guī)則，但仍不明顯；而加載后12 h和24 h，細(xì)胞明顯順應(yīng)其應(yīng)力方向，呈有序排列（圖1）。

2.2 在C2C12細(xì)胞成肌分化過程中周期性機(jī)械拉伸

對p38MAPK活性的影響

周期性機(jī)械拉伸在調(diào)控C2C12成肌細(xì)胞分化過程中，p38MAPK信號通路被激活。與相應(yīng)的對照組比較，p38MAPK信號通路蛋白磷酸化水平在加力2 h后增加，加力6 h后磷酸化水平達(dá)到峰值（P<0.01）；加力12 h和24 h，磷酸化水平稍有下降，但仍然維持在較高水平（P<0.05）。而總p38蛋白表達(dá)維持在一基線水平，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2、3）。

2.3 張應(yīng)力及SB203580對Myogenin蛋白表達(dá)的影響

周期性張應(yīng)力促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞分化過程中Myogenin的表達(dá)，與對照組和加力+SB203580組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001，P<0.01）。加入SB203580后再加力，可明顯抑制Myogenin的表達(dá)，但與對照組比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

3 討論

3.1 應(yīng)力控制成肌細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

近年來，隨著骨骼肌再生、損傷后修復(fù)與適應(yīng)性改建的研究受到廣泛關(guān)注，有關(guān)骨骼肌細(xì)胞的增殖、凋亡和分化在骨骼肌再生中的作用研究也逐漸興起。細(xì)胞外基質(zhì)的一些信號參與調(diào)控成肌過程，其中力學(xué)應(yīng)激是維持細(xì)胞生存和生長的重要細(xì)胞外刺激，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝和基因表達(dá)過程，在骨骼肌的形成和發(fā)育中起重要的作用[5-8]。

近年來，對細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)刺激潛在機(jī)制的研究已發(fā)展成為重要的生理學(xué)研究的新領(lǐng)域[9]。通過對力

學(xué)刺激作用于肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的研究，證實(shí)了不同的力學(xué)刺激所激活的信號通路并不完全相同，正是通過這些特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活、封閉或者不同通路之間的cross-talk途徑，從而對成肌轉(zhuǎn)錄因子及骨骼肌標(biāo)志性蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，對肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化能力產(chǎn)生影響。研究證實(shí)：周期性張應(yīng)力通過激活其下游信號分子——黏附斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和RhoA，在調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[10]。Charrasse等[11]研究表明：M-鈣黏附分子介導(dǎo)的信號途徑參與了成肌細(xì)胞相互融合形成肌管的過程。Ku-mar等[12]卻發(fā)現(xiàn)周期性拉伸可通過FAK、Rac-1、G蛋白及核因子-κB等信號分子抑制C2C12成肌細(xì)胞分化成肌小管。另外，F(xiàn)ormigli

等[13]的研究證實(shí)：應(yīng)力活化型離子通道在成肌過程中起重要作用。筆者在成功構(gòu)建SD大鼠乳鼠成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)力學(xué)刺激模型的基礎(chǔ)上，研究了肌細(xì)胞膜上重要的Na+通道蛋白—Na+-K+-ATPase在力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用及其調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)：周期性張應(yīng)力通過內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)成肌細(xì)胞膜上Na+-K+-ATPase α亞基蛋白的表達(dá)，并改變Na+-K+-ATPase的功能活性。筆者研究證實(shí)：Na+-K+-ATPase是成肌細(xì)胞感受力學(xué)信號并進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號分子[12，14-15]。然而，關(guān)于何種信號途徑在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞分化中起主要作用，迄今為止還沒有被完全認(rèn)識。由于MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的主要通道之一，參與細(xì)胞的形成、運(yùn)動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程[16]，故本研究選用

MAPKs信號通路。

3.2 成肌細(xì)胞與MRFs

MRFs是骨骼肌胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的一組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，MRFs家族共有4個成員：MyoD、Myf25、Myogenin、MRF4。這些MRFs共有一個與E2蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合形成二聚體所需的DNA結(jié)合域bHLH、MRF2E蛋白異二聚體和MRF單體結(jié)合到共有的E2盒序列CANNTG，而CANNTG存在于骨骼肌成肌特異基因的增強(qiáng)子元件中，調(diào)控著這些成肌分化特異因子的轉(zhuǎn)錄活性。MyoD和Myf25之間是成肌分化的決定因子，在成肌細(xì)胞分化前表達(dá)，兩者的作用都是誘導(dǎo)前成肌細(xì)胞分化成成肌細(xì)胞。MyoD基因是骨骼肌細(xì)胞分化的決定性基因，是肌分化的發(fā)動者，它們是骨骼肌最早的成肌標(biāo)志之一。Myogenin和MRF4均在分化中表達(dá)，作用都是誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化融合成肌管。增殖的成肌細(xì)胞在分化激活之前表達(dá)MyoD和Myf25，一旦分化被激活MyoD和Myf25則誘導(dǎo)細(xì)胞推出細(xì)胞周期，同時表達(dá)Myogenin。Myogenin和MRF4調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞進(jìn)一步終末分化為肌管肌纖維。Myo-genin基因敲除的小鼠因成肌細(xì)胞不能融合成肌管而無肌肉形成，MRF4敲除的小鼠有正常的肌肉形成，但因Myogenin的表達(dá)量增加，可導(dǎo)致新生小鼠肋骨嚴(yán)重畸形。因此Myogenin是成肌分化必不可少的因子[17-18]。實(shí)驗(yàn)性肌損傷時，12 h以內(nèi)MyoD在細(xì)胞增

殖標(biāo)志的增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)前迅速上調(diào)，而Myo-genin在融合和分化期間持續(xù)表達(dá)，因此實(shí)驗(yàn)對于成肌分化的研究常選擇檢測Myogenin的表達(dá)變化。

3.3 p38MAPK通路與成肌細(xì)胞分化的調(diào)控

MAPKs級聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。到目前為止，在真核生物細(xì)胞中已明確了5條MAPKs通路，每個亞家族又包含多個亞型。p38MAPK是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第三種細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是近年來細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[17]。在靜止的細(xì)胞中，p38MAPK定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，活化的p38MAPK進(jìn)一步磷酸化下游的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的分化和凋亡及多種細(xì)胞反應(yīng)[19]。p38MAPK信號通路是

生物信號引起核反應(yīng)的重要通路，在細(xì)胞生長、死亡、細(xì)胞周期、炎癥及其應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致蛋白合成、細(xì)胞表面受體表達(dá)、細(xì)胞骨架重構(gòu)。

p38MAPK通路在成肌細(xì)胞分化中起著重要作用。de Angelis等[19]研究表明：在成肌細(xì)胞分化過程中，

p38MAPK活性增強(qiáng)，使肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2磷酸化，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。Lluís等[20]也發(fā)現(xiàn)：p38可以激活MyoD，從而直接參與成肌細(xì)胞分化早期調(diào)控。此外，p38MAPK促進(jìn)了p21的表達(dá)，p21通過抑制周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）的活性，促使細(xì)胞從細(xì)胞周期中退出，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步分化[21]。同時，p38MAPK通路也是骨骼肌感受機(jī)械刺激的重要信號通路[22]。因此，筆者推測：p38MAPK可能在

應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞分化過程中起重要作用，而且其分子機(jī)制尚未闡明。明確p38MAPK信號通路在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞分化中的作用及其激活機(jī)制，為探討通過干預(yù)p38MAPK信號通路的激活促進(jìn)細(xì)胞分化具有積極意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：周期性機(jī)械拉伸在調(diào)控C2C12成肌細(xì)胞分化過程中，p38MAPK信號通路被激活，蛋白磷酸化水平在加力6 h內(nèi)達(dá)到峰值；繼續(xù)加力，蛋白的表達(dá)稍有下降，但仍然維持在較高水平。而總p38MAPK蛋白表達(dá)維持在一基線水平，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。通過本實(shí)驗(yàn)可得出：p38MAPK信號通路參與了應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞分化的過程，在應(yīng)力介導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞分化中起重要作用。

上述結(jié)果尚不能夠說明p38MAPK信號通路在應(yīng)力介導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞分化中的唯一性，但至少肯定參與了此調(diào)控過程。為了進(jìn)一步確證p38MAPK信號通路的重要性以及唯一性，筆者使用p38MAPK信號通路的特異性阻斷劑SB203580，從反面進(jìn)行印證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：周期性張應(yīng)力促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞分化過程中Myogenin的表達(dá)，加入SB203580后再加力，Myogenin表達(dá)明顯降低；但加力+SB203580組與對照組比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義，提示p38MAPK信號通路是參與應(yīng)力介導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞分化調(diào)控過程的信號通路，但不是唯一通路；其他的信號通路也可能參與這一過程，需要深入研究。

由此可見，應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞分化的信號通路的相關(guān)研究是非常復(fù)雜的，而機(jī)體對于這一過程進(jìn)行調(diào)控的精確性也是非常有意義的，對于深層次上闡明應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制是非常重要的。因?yàn)檫@一機(jī)制的闡明，將為探討通過干預(yù)信號傳導(dǎo)通路調(diào)控成肌細(xì)胞分化，抑制其凋亡，從而促進(jìn)肌肉再生和肌肉改建提供理論依據(jù)，而且也為航天員失重性肌肉萎縮的防治提供新思路，因而具有深遠(yuǎn)的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用前景。

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（本文編輯 杜冰）