非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2與核因子—κB在糖尿病牙周炎牙周組織破壞中的作用研究

[摘要] 目的 觀察糖尿病牙周炎條件下小鼠牙周組織中非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）、核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)與牙周組織破壞的關(guān)系。方法 將4周齡健康雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組）、單純牙周炎組（P組）及糖尿病牙周炎組（DP組），每組6只。采用口內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌法在P組建立牙周炎模型，采用腹腔注射鏈脲佐菌素結(jié)合高脂高糖食物與口內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌法在DP組建立糖尿病牙周炎模型。各組動(dòng)物于P、DP組末次細(xì)菌接種4周后處死，通過體視顯微鏡觀察牙槽骨形態(tài)和附著喪失面積，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察牙周附著喪失的高度，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)牙周組織中PTPN2與NF-κB的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果 P、DP組牙槽骨的附著喪失面積和牙周附著喪失高度均高于N組（P<0.05），PTPN2的表達(dá)量低于N組（P<0.05），而NF-κB的表達(dá)量則高

于N組（P<0.01）。結(jié)論 在糖尿病牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB可能有促進(jìn)作用，而PTPN2可能有抑制作用；

PTPN2的表達(dá)減少可能導(dǎo)致NF-κB表達(dá)增強(qiáng)而加重牙周組織破壞。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病； 牙周炎； 非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2； 核因子-κB

[中圖分類號(hào)] R 781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.009

有研究[1]顯示：糖尿病患者罹患牙周炎時(shí)，其炎癥反應(yīng)較非糖尿病患者嚴(yán)重，進(jìn)展迅速，易造成明顯的牙周組織破壞。如何有效地預(yù)防和治療糖尿病患者的牙周炎，是目前臨床工作中的難點(diǎn)之一。患牙周炎時(shí)，過度的炎癥反應(yīng)是造成牙槽骨等牙周組織損害的重要原因之一。侵入牙周組織的細(xì)菌能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑，導(dǎo)致多種炎性細(xì)胞的活化和炎癥因子的過表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，最終導(dǎo)致牙周組織破壞[2]。有研究[3]表明：非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2，PTPN2）在免疫、炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)水平降低與一些免疫、炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在糖尿病牙周炎條件下，牙周組織中PTPN2和NF-κB的表達(dá)與牙周組織破壞有何種關(guān)系，國(guó)內(nèi)外的研究還較少。本文通過觀察實(shí)驗(yàn)性糖尿病牙周炎小鼠模型牙周組織中PTPN2、NF-κB的表達(dá)與牙周組織破壞的關(guān)系，探討PTPN2、NF-κB蛋白在糖尿病牙周炎中參與牙周組織損害的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PTPN2兔抗多克隆抗體（Biotech公司，美國(guó)），NF-κB鼠抗單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；

SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技

術(shù)有限公司）；體視顯微鏡（Olympus公司，日本），

Nikon 80i型顯微鏡（Nikon公司，日本），2035型切

片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）。

1.2 動(dòng)物分組及牙周炎小鼠模型的構(gòu)建

4周齡16～18 g的健康雄性C57BL/6J小鼠18只（四川大學(xué)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（N組）、單純牙周炎組（P組）及糖尿病牙周炎組（DP組），每組6只。N組按無特定病原體（specific patho-

gen free，SPF）級(jí)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。DP組喂飼高脂高糖食物，并按55 mg·kg-1腹腔注射STZ，每天1次，連續(xù)注射5 d；末次注射1周后檢測(cè)血糖，若血糖≥16.65 mmol·L-1確認(rèn)糖尿病動(dòng)物模型建立成功[4]。確認(rèn)建模成功1周后，各組小鼠均給予正常飲食。P、DP組在1%戊巴比妥鈉麻醉下通過口內(nèi)涂布的方

式接種牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，

P.gingivalis）建立牙周炎模型。P. gingivalis的密度為

1×109 CFU·mL-1，接種0.05 mL，連續(xù)接種5次，隔日接種。接種菌液由保存菌種P. gingivalis ATCC 33277活化增菌后，挑取平板上活的單個(gè)菌落，用加入2%羥甲基纖維素的無菌PBS配成密度為1×109 CFU·mL-1的

菌懸液。接種時(shí)在小鼠每個(gè)后牙的齦溝內(nèi)涂布菌液。末次接種4周后處死各組小鼠（處死動(dòng)物前再次檢測(cè)血糖確定DP組小鼠血糖值≥16.65 mmol·L-1），取上下頜組織進(jìn)行觀察；將上頜組織進(jìn)行常規(guī)固定、脫鈣、石蠟包埋，制作切片；分離下頜軟組織，洗凈下頜骨，干燥備用。

1.3 體視顯微鏡觀察后牙牙槽骨的附著喪失面積

取各組小鼠下頜骨進(jìn)行體視顯微鏡檢查，在放大15倍情況下計(jì)算全部后牙牙槽骨的附著喪失面積，即所有后牙牙槽嵴頂?shù)接匝拦琴|(zhì)界之間的面積。

1.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察

牙周附著喪失的高度

取上頜組織沿第二磨牙頰舌向連續(xù)切片，HE染色，鏡下觀察牙周組織病損情況，計(jì)算第二磨牙頰、舌側(cè)牙周組織附著喪失高度（即牙周袋底部至釉牙骨

質(zhì)界之間的高度）并取均值作為該牙的附著喪失高度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色觀察PTPN2和NF-κB的表達(dá)

取上頜組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP法染色，PTPN2兔抗多克隆抗體（1∶100）、NF-κB鼠抗單克隆抗體（1∶100）為一抗，PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

PTPN2、NF-κB陽性信號(hào)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。每個(gè)標(biāo)本選取具有較明顯牙周炎病理表現(xiàn)的3張切片，每張切片在100倍視野下選取著色最強(qiáng)的區(qū)域，換至400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝

照片，應(yīng)用Image Pro-plus圖像分析軟件測(cè)量每張切片的平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用x±s表示，組間差異采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體視顯微鏡觀察結(jié)果

體視顯微鏡下，下頜后牙牙槽骨附著喪失面積的測(cè)量結(jié)果見表1，其形態(tài)學(xué)變化見圖1。

由表1可見：N組的附著喪失面積低于P和DP組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組和DP組附著喪失面積的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由圖1可見：N組牙槽骨形態(tài)較正常，未出現(xiàn)明顯骨吸收（圖1A）；P、DP組可見牙槽嵴頂高度降低，牙槽骨表面有骨吸收陷窩，根分叉暴露（圖1B、C）。

2.2 HE染色結(jié)果

采用HE染色觀察上頜牙槽骨的形態(tài)學(xué)變化見圖2，其附著喪失高度的測(cè)量結(jié)果見表1。由圖2可見：

N組附著喪失很少（圖2A）；P、DP組有牙周袋形成，上皮釘突增生成網(wǎng)狀，牙周組織中有慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2B、C）。由表1可見：N組的附著喪失高度小

于P和DP組（P<0.05），而P和DP組附著喪失高度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

3組的免疫組織化學(xué)染色情況見圖3，其AOD測(cè)量結(jié)果見表1：PTPN2蛋白在正常牙齦上皮細(xì)胞、牙周結(jié)締組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)，在N組的表達(dá)強(qiáng)度高于P組及DP組（P<0.05），而P組和

DP組表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；NF-κB表達(dá)于牙周組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，在N組的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于P組及DP組（P<0.01），而P組和DP組表達(dá)強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

牙周炎是主要的口腔疾病之一，在糖尿病患者中具有較高的發(fā)病率，是糖尿病的第六大并發(fā)癥。因其常導(dǎo)致嚴(yán)重的附著喪失與骨吸收，極大地影響患者的生活質(zhì)量，所以糖尿病牙周炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治手段在牙周疾病研究中倍受關(guān)注。

患有糖尿病時(shí)，宿主對(duì)病原微生物產(chǎn)生的過度炎癥反應(yīng)是造成牙周組織破壞的重要原因。作為一種真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的激活與多種炎癥性疾病密切相關(guān)。在正常生理情況下，NF-κB常與其抑制蛋白（inhibitor κB，I-κB）家族成員結(jié)合，以無活性復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞中；當(dāng)病原微生物及其產(chǎn)物如內(nèi)毒素等細(xì)胞外信號(hào)作用于細(xì)胞時(shí)，可激活相應(yīng)受體將信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使I-κB磷酸化并與NF-κB解離，導(dǎo)致NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[5]。有學(xué)者[6]發(fā)現(xiàn)：牙周炎患者牙周組織

細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的激活率遠(yuǎn)高于正常組織；在另外的研究[7-8]中發(fā)現(xiàn)：牙周致病菌P. gin-

givalis侵入牙齦上皮細(xì)胞時(shí)會(huì)激活NF-κB途徑，引起白細(xì)胞介素等炎癥因子的生成增加，并可趨化中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞到感染部位，引發(fā)炎癥反應(yīng)。此外，NF-κB可抑制中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞的正常凋亡，使其死亡從而崩解釋放多種破壞牙周組織的酶，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[2]。已有研究[9]發(fā)現(xiàn)：NF-κB與糖尿病狀態(tài)

下的炎癥損傷調(diào)節(jié)有重要的關(guān)系，降低NF-κB的水平可有效改善糖尿病患者神經(jīng)系統(tǒng)的炎性病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，糖尿病牙周炎小鼠的牙周組織有明顯的附著喪失，出現(xiàn)牙周袋及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且NF-κB表達(dá)增強(qiáng)。其可能機(jī)制為細(xì)菌感染牙周組織時(shí)，牙齦成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的NF-κB途徑被激活，引起白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子釋放，趨化并活化炎癥細(xì)胞，釋放更多的炎性介質(zhì)，致使炎癥反應(yīng)加劇并加重組織損傷，如誘導(dǎo)結(jié)締組織間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶使間質(zhì)中的膠原降解，刺激基質(zhì)細(xì)胞凋亡限制牙周組織修復(fù)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及骨吸收等[10-11]。有學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病條件下，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞對(duì)細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素的反應(yīng)更為敏感，能釋放更多的炎癥因子，并使炎癥反應(yīng)延長(zhǎng)，這能促進(jìn)糖尿病并發(fā)的炎癥反應(yīng)出現(xiàn)嚴(yán)重的破壞且進(jìn)展迅速。本實(shí)驗(yàn)中，DP組小鼠的牙周附著喪失量、NF-κB表達(dá)量的測(cè)量值與P組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以考慮在下一步實(shí)驗(yàn)中采用Micro CT、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)、免疫印跡法等靈敏度更高的方法進(jìn)一步檢測(cè)組間的差異。

PTPN2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成員，有兩種mRNA編輯方式：一種編碼形成相對(duì)分子質(zhì)量為4.8×104的蛋白質(zhì)，稱為TC48，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體；另一種編碼形成相對(duì)分子質(zhì)量為4.5×104的蛋白質(zhì)，稱為TC45，定位在細(xì)胞核內(nèi)[3]。TC45發(fā)

揮主要的生物學(xué)作用，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，TC45游離出細(xì)胞核，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)，如表皮生長(zhǎng)因子受體、蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of

transcription，STAT）等去磷酸化，抑制下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)[3]。在敲除PTPN2的動(dòng)

物模型體內(nèi)，血清中腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)的水平升高，并出現(xiàn)廣泛而嚴(yán)重的炎癥性疾病[13]。本實(shí)

驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DP組和P組小鼠的牙周組織中出現(xiàn)明顯的組織破壞及炎癥反應(yīng)，同時(shí)PTPN2的表達(dá)低于N組，提示PTPN2的表達(dá)水平下降可能是造成牙周炎癥反應(yīng)加劇及組織損傷的原因之一。可能機(jī)制是PTPN2能抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2相互作用，抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；它能使集落刺激因子-1受體及Src酪氨酸激酶去磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制單核細(xì)胞的增殖、分化與炎性反應(yīng)；它可降低JAK的酪氨酸磷酸化程度，并可使STAT上的酪氨酸去磷酸化以調(diào)節(jié)STAT的活性，進(jìn)一步下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制干擾素-γ、白細(xì)胞介素-6介導(dǎo)的基因表達(dá)與炎癥反應(yīng)，減少組織損害[14-15]，而PTPN2表達(dá)減少時(shí)，這些作用減弱，可以加速牙周組織的破壞。

本實(shí)驗(yàn)顯示，與正常小鼠相比，糖尿病牙周炎

與單純牙周炎小鼠的牙周組織中PTPN2表達(dá)減少，

同時(shí)NF-κB表達(dá)增高，提示PTPN2可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)影響牙周炎的進(jìn)程，其機(jī)制可能是PTPN2表達(dá)下降，抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α以及抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)作用減弱，而TNF-α可以促使中性粒細(xì)胞活化并釋放活性氧，使I-κB磷酸化并激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)及組織破壞[16]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察到糖尿病牙周炎時(shí)牙周組織中NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，PTPN2表達(dá)減弱，提示在糖尿病牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB可能有促進(jìn)作用，PTPN2可能有抑制作用，且PTPN2的表達(dá)水平下降可能導(dǎo)致NF-κB表達(dá)增多而加重牙周組織的破壞。了解這些因子相互作用的機(jī)制及其與牙周破壞之間的關(guān)系，有助于為今后尋找糖尿病牙周炎的防治措施提供新思路。

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（本文編輯 吳愛華）