微小核糖核酸—21反義寡核苷酸對人舌鱗癌細胞生長抑制的體內研究

[摘要] 目的 研究微小核糖核酸-21（miR-21）反義寡核苷酸（AS-miR-21）對人舌鱗癌生長的抑制作用。方法 采用穩定轉染pGL6熒光素酶報告基因質粒的舌鱗癌細胞Tca8113-luc接種裸鼠，建立移植瘤動物模型，瘤體內注射AS-miR-21，應用活體成像和TUNEL等實驗技術進行AS-miR-21對人舌鱗癌細胞系生長抑制的體內研究。結果 通過轉染pGL6熒光素酶報告基因質粒構建了穩定表達熒光素酶活性的Tca8113-luc細胞株。裸鼠皮下荷瘤模型成瘤率高，腫瘤生長穩定。在瘤體內注射AS-miR-21后腫瘤生長減慢，活體成像中光子數偏低，腫瘤標本中壞死灶少見，細胞核變小，染色變淺，異型性減低，新生血管數減少。腫瘤組織中miR-21表達明顯下降，凋亡指數升高。結論 腫瘤內注射AS-miR-21可以降低舌鱗癌細胞中miR-21的表達，促進舌鱗癌腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的生長。

[關鍵詞] 舌鱗癌； 微小核糖核酸-21； 微小核糖核酸-21反義寡核苷酸； 基因治療； 活體成像

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.002

靶向微小核糖核酸-21（micro ribonucleic acid-

21，miR-21）的反義寡核苷酸可以有效抑制舌鱗癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，抑制細胞的遷移和侵襲能力。筆者采用穩定轉染pGL6熒光素酶報告基因

質粒的舌鱗癌細胞Tca8113-luc接種裸鼠，建立舌鱗癌移植瘤動物模型，利用脂質體OligofectamineTM為載體，瘤體內注射miR-21反義寡核苷酸（antisense-

miR-21 oligonucleotide，AS-miR-21），應用活體成像和TUNEL等實驗技術進一步進行AS-miR-21對人舌鱗狀細胞癌細胞系生長抑制的體內研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人舌鱗癌細胞系Tca8113由上海交通大學口腔腫瘤生物實驗室建立并提供。

1.1.2 siRNA oligo 根據microRNA數據庫（http：//www.sanger.ac.uk）提供的基因序列，獲取人miR-21的序列，依序列互補原理設計相應的反義寡核苷酸序列和隨機對照序列，并采用BLAST軟件分析，人工合成的寡核苷酸序列以2’O-Me修飾。AS-miR-21序列：5’-GUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’；Scrambled序列：5’-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3’。

1.1.3 質粒 pGL6熒光素酶報告基因質粒購自江蘇碧云天生物技術公司，含有熒光素酶編碼luc基因和G418抗性的Neo基因。

1.1.4 實驗動物 BALB/c-nu（SPF）雌性裸小鼠，4～6周齡，體重15～18 g，共24只，購自北京大學醫學部實驗動物科學部。

1.1.5 主要試劑和儀器 LipofectamineTM及Oligofec-tamineTM Reagent（Invitrogen公司，美國），TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物公司），精諾真活體動物體內可見光成像系統IVIS200及氣體麻醉系統XGI-8（Xenogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理方法 將Tca8113細胞常規復蘇、傳代，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養，選用對數生長期、0.2%臺盼藍拒染率>95%的細胞。

1.2.2 質粒擴增提純及質粒酶切、轉染 按德國Qia-gen公司大量質粒擴增純化試劑盒要求擴增提純pGL6熒光素酶報告基因質粒后，以Hind Ⅲ酶切并再次提純，利用LipofectamineTM將其穩定轉染Tca8113細胞。

1.2.3 細胞篩選及穩定表達熒光素酶基因細胞克隆的培養和鑒定 以G418篩選穩定表達熒光素酶基因的Tca8113-luc細胞，培養細胞克隆。倍比稀釋細胞克隆，采用可見光成像系統成像，檢測Tca8113-luc細胞熒光素酶基因表達效率，分析熒光強度與細胞數之間的相關性，繪制Tca8113-luc細胞生長曲線。

1.2.4 人舌鱗癌Tca8113-luc裸鼠模型的建立 將24只裸鼠隨機分為空白對照（control）組、無義序列（Scr-miR）組和反義序列（AS-miR-21）組，每組8只。取對數生長期的Tca8113-luc細胞，調整細胞濃度至每毫升1×107個，每只200 μL接種于裸鼠右側鼠蹊部皮下。

1.2.5 裸鼠荷瘤生長及治療情況 接種腫瘤細胞第15天，23只裸鼠成瘤，成瘤率為95.83%，腫瘤大小為（0.109±0.076） cm3，最小腫瘤為0.2 cm×0.2 cm時開

始治療。將20 pmol·μL-1的AS-miR-21及Scrambled寡核苷酸各150 μL分別與60 μL OligofectamineTM Rea-gent混勻后，以無菌微量注射器腫瘤內多點緩慢注射，每只裸鼠每次注射混合物25 μL。每4 d治療1次，至觀察期結束（4周）。自裸鼠開始治療之日起，每次

治療前用游標卡尺測量腫瘤長徑（a）及寬徑（b），腫瘤體積計算公式為：V=（ab2）/2；觀察腫瘤界限，浸潤情況，有無壞死、破潰、感染及裸鼠全身狀況。

1.2.6 活體成像 裸鼠接種Tca8113-luc細胞當日及之后每7 d行活體成像1次。電子天平稱重后腹腔注射熒光素酶底物150 mg·kg-1體重（含量為15 mg·mL-1），以氣體麻醉系統XGI-8麻醉，待底物作用10 min后，將裸鼠按順序放入暗箱，平臥位，曝光成像。屏蔽原位瘤，可成像觀察有無淋巴結及遠處轉移。應用成像系統軟件完成圖像分析過程。

1.2.7 裸鼠腫瘤組織實時熒光定量聚合酶鏈反應（po-lymerase chain reaction，PCR）、蘇木精-伊紅（hema-

toxylin-eosin，HE）及TUNEL檢測 治療后第28天斷頸處死所有裸鼠，解剖原位腫瘤，提取RNA后行實時熒光定量PCR檢測miR-21表達；原位腫瘤及腫大淋巴結常規石蠟包埋切片，HE染色行腫瘤組織病理檢查；石蠟切片FITC標記POD法進行TUNEL實驗，檢測細胞凋亡，陽性結果判斷標準：紫外光下所有細胞核均被染成藍色，在495 nm激發波長下可在熒光顯微鏡下看到凋亡細胞細胞核的綠色熒光。每張切片隨機選取8個視野（400×），每個視野至少計數100個細胞，計算細胞凋亡指數，以百分比表示。

1.3 統計學分析

采用SPSS 10.0統計軟件包對所有數據進行統計分析，實時熒光定量PCR采用ANOVA單因素方差分析；計量資料（或經轉換后變為計量資料）多組間均數的比較采用單因素方差分析；光子數和細胞數的關系分析采取二元變量的相關分析，P<0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 Tca8113細胞G418最佳篩選濃度

Tca8113細胞G418最佳篩選濃度為400 μg·mL-1。篩選穩定表達熒光素酶基因的Tca8113-luc細胞時所用濃度為基準濃度高一級，即600 μg·mL-1，維持濃度為篩選濃度的半量，即300 μg·mL-1。

2.2 Tca8113-luc細胞熒光素酶活性檢測

Tca8113-luc細胞經過G418篩選后，得到穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆，倍比稀釋，最低檢測到78個細胞的熒光素酶活性。細胞數和光子數的線性關系見圖1。光子數與細胞數相關系數R為1，表明二者相關性極強，提示Tca8113-luc細胞能穩定表達熒光素酶基因，有較強的熒光素酶活性。

2.3 Tca8113-luc細胞系生長曲線

Tca8113和Tca8113-luc細胞在較長生長周期內基本一致，表明Tca8113-luc細胞構建過程沒有對細胞生長特性產生影響（圖2）。

2.4 荷瘤裸鼠治療中腫瘤變化情況

腫瘤體積變化曲線中，空白對照組和Scr-miR組腫瘤生長速度較快，且成瘤后從第9天開始明顯加快，2組腫瘤體積差異無統計學意義。AS-miR-21組腫瘤生長速度慢，腫瘤體積較小，但治療21 d前3組間差異無統計學意義（P>0.05）。從第21天起，AS-

miR-21組腫瘤體積與另外2組腫瘤生長出現明顯差異（P<0.05），這種差異持續到觀察期結束（圖3）。

所有裸鼠腫瘤全部界限清楚，無明顯浸潤，未見轉移灶。空白對照組和Scr-miR組較大的腫瘤有明顯出血、液化和壞死，局部表面有潰破；荷瘤較大的裸鼠全身狀況較差，體重減輕。而AS-miR-21組腫瘤個體較小，均為實體性，無明顯液化、壞死灶。AS-miR-21組裸鼠瘤體內注射AS-miR-21后能減緩腫瘤生長（腫瘤沒有減小但生長速度變慢，生長趨勢

減緩）（圖4）。

2.5 活體成像

每只裸鼠接種部位均有熒光成像，且光子數比較均一，提示接種于裸鼠的Tca8113-luc細胞能穩定表達熒光素酶活性（圖5）。

實驗第1周裸鼠接種腫瘤細胞至第3周裸鼠成瘤，活體成像光子數無差異（圖6、7）。經AS-miR-21治

療2周后，光子數出現差異，AS-miR-21組數值明顯低于其他2組，表明AS-miR-21有效抑制了腫瘤的生長。而在治療第3周之后，空白對照組和Scr-miR組的光子數有所下降，使3組間的差別消失。活體成像顯示各組裸鼠腫瘤均未見遠處和淋巴結轉移。

2.6 HE染色檢測腫瘤組織病理學改變

裸鼠腫瘤病理形態觀察結果見圖8。空白對照組及Scr-miR組腫瘤細胞生長旺盛，形態不規則，細胞核大，染色深，核分裂相多見，異型性明顯，瘤巨細胞較多，新生血管數也較多，腫瘤內出現大面積壞死。而AS-miR-21組腫瘤壞死灶少見，細胞核小，染色變淺，異型性減低，新生血管數減少。所有腫瘤組織可見少量炎性細胞浸潤。切取的腫大淋巴結均為正常淋巴結組織，未見轉移癌。

2.7 裸鼠腫瘤組織中miR-21的表達

實時熒光定量PCR產物電泳結果見圖9。AS-

miR-21組miR-21表達比空白對照組和Scr-miR組明顯減低。裸鼠經AS-miR-21治療后，腫瘤組織中的miR-21表達下降，分別是空白對照組及Scr-miR組的36%和29.5%，二者間差異有統計學意義（P<0.05）；空白對照組及Scr-miR組間差異無統計學意義。

2.8 TUNEL原位凋亡檢測

紫外光下所有細胞核均被染成藍色，凋亡細胞在495 nm激發波長下可在熒光顯微鏡下觀察到細胞核的綠色熒光（圖10）。AS-miR-21治療后凋亡細胞

數明顯增多，凋亡指數為37%，與空白對照組和Scr-miR組比較差異有統計學意義（P<0.05）。提示瘤體內

注射AS-miR-21能有效促進舌鱗癌腫瘤細胞凋亡。

3 討論

miRNA在細胞的增殖、分化等方面發揮著重要的調節作用，是腫瘤發生發展過程中基因表達的有力調節者。以miRNA為靶點設計的基因藥物為研究腫瘤的發生、發展及基因治療提供了新的手段和途徑。當miRNA在腫瘤中低表達或作為腫瘤抑癌基因時，可以采用miRNA的替代療法，在腫瘤組織中用病毒或脂質體等系統轉染模擬內源性miRNA的人工合成的miRNA，使其過量表達，以達到靶向抑制腫瘤、誘導調亡的作用[1]。而當miRNA在腫瘤中高表達

或作為癌基因時，導入與miRNA互補的反義寡聚核苷酸序列，與miRNA結合形成雜化雙鏈，激活RNA酶H，進而降解并抑制miRNA活性，干擾其表達水平，被認為是目前最好的方法[2]。

此前的體外實驗研究證實口腔鱗癌中存在miR-21高表達。它發揮著原癌基因的作用，通過反向調節腫瘤抑制基因和/或控制細胞分化或凋亡的基因而促進腫瘤的形成[3]，在腫瘤的發生發展中發揮著重要

作用。miR-21與腫瘤細胞增殖、抗凋亡及侵襲性相關的功能，以及其對多種促凋亡抗侵襲的腫瘤抑制基因的直接調控，使其序列特異性的抑制物能對癌癥中表達失調的多種蛋白進行生理性調控，為癌癥提供一個新的治療途徑[4-7]。

筆者采用穩定轉染pGL6熒光素酶報告基因質粒的Tca8113-luc細胞接種裸鼠，建立移植瘤動物模型，通過瘤體內給藥，進行AS-miR-21對人舌鱗狀細胞癌細胞系生長抑制的體內研究。通過對裸鼠進行為期28 d的治療和觀察，AS-miR-21組腫瘤生長速度慢，腫瘤體積較小，腫瘤標本中壞死灶少見，細胞核變小，染色變淺，異型性減低，新生血管數減少。經實時熒光定量PCR檢測表明裸鼠經AS-miR-21治療后，腫瘤細胞中miR-21表達明顯下降，TUNEL檢測顯示AS-miR-21組凋亡指數升高，提示以Oligofec-tamineTM為載體行AS-miR-21瘤體內注射可有效降低腫瘤細胞中miR-21的表達，有效促進舌鱗癌腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，提示了AS-miR-21作為人口腔鱗癌治療靶標的可能性。

活體生物體內成像技術已經廣泛應用于生命科學、醫學研究及藥物開發等方面[8-9]。本研究利用脂質體轉染法，將酶切后的pGL6熒光素酶報告基因質粒轉入Tca8113細胞中。應用G418（最佳篩選終濃度為400 μg·mL-1）篩選出穩定表達熒光素酶活性的

Tca8113-luc細胞系。將Tca8113-luc細胞接種于裸鼠，建立舌癌的動物模型，以進行活體成像實驗。觀測前需注射熒光素酶底物—熒光素。美國Xeno-gen公司生產的IVIS成像系統，在動物體內可監測到102個細胞[10-12]。筆者構建的Tca8113-luc細胞株在接種于裸鼠當時及接種后2周成瘤時均有熒光素酶表達且接種腫瘤細胞和成瘤時各組活體成像光子數測定無差別。隨著腫瘤的增長，空白對照組和Scr-miR組熒光值快速增加，在成瘤治療后2周就已達到飽和，到第3周時，腫瘤中心已出現壞死，中心熒光值降低。而AS-miR-21組的熒光值增加則比較緩慢，從治療后2周就與其他兩組有顯著性差異。但到第3周以后，空白對照組和Scr-miR組由于部分腫瘤體積較大，發生液化壞死，使熒光值降低，各組之間無差異。實驗觀察期為4周，可明顯看到對照組和實驗組的腫瘤生長體積的差別。但后期各組活體成像的熒光信號差異卻與各組腫瘤大小差異產生矛盾，考慮可能是空白對照組和Scr-miR組腫瘤組織產生了大量壞死，使活體成像信號減弱的原因。但如果縮短觀察時間又無法足夠且正確地評價AS-miR-21對腫瘤的抑制作用。這個問題還有待于進一步探索解決。應用活體成像監測Tca8113-luc腫瘤體內生長情況，治療前后各組均未發現腫瘤有淋巴結和遠處轉移，這可能和腫瘤細胞的接種方式有關。應用的是鼠蹊部皮下成瘤的方法，如果采用細胞尾靜脈注射裸鼠成瘤，得到腫瘤轉移模型的可能性會增加，將使AS-miR-21對腫瘤生長、轉移的抑制作用得到更有說服力的體現。

隨著人類基因組計劃的完成、細胞分子生物學技術的發展和其他腫瘤治療手段的日益完善，基因治療可望成為腫瘤治療的又一常規手段。通過細胞特異性病毒或脂質體，把靶標miR-21抑制劑傳送至疾病的（如腫瘤）細胞中，可以作為miR-21抑制作用的一項有效途徑。無論如何，miR-21與人類多種疾病的密切相關及其在許多關鍵癌基因中的調控作用使這個小分子成為日后研究和基因治療的一個重要的靶標。

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（本文編輯 杜冰）