內皮細胞型一氧化氮合成酶Glu298Asp基因多態性與牙周炎伴Ⅱ型糖尿病的相關性研究

[摘要] 目的 研究內皮細胞型一氧化氮合成酶（eNOS）Glu298Asp基因多態性與牙周炎伴Ⅱ型糖尿病易感性的關

系。方法 收集慢性牙周炎患者、慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病患者、Ⅱ型糖尿病患者和牙周健康者的頰黏膜拭子，提取DNA后應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法檢測eNOS Glu298Asp的基因型分布。結果 慢性牙周炎組、Ⅱ型糖尿病組、慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病組、正常組eNOS Glu298Asp基因型的分布差異有統計學意義（?2=18.503，P=0.005），等位基因頻率分布差異也有統計學意義（?2=8.243，P=0.041）。慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病組與正常組相

比，T基因型的OR值為0.962，95%可信區間為0.737～1.256，說明T基因型可能為糖尿病和牙周炎的保護因素；G基因型的OR值為1.043，95%可信區間為0.781～1.391，說明G基因型可能為二者的危險因素，但差異無統計學意義。結論 慢性牙周炎、慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病、糖尿病的易感性可能與eNOS Glu298Asp多態性有關。

[關鍵詞] 慢性牙周炎； Ⅱ型糖尿病； 一氧化氮合成酶； 基因多態性

[中圖分類號] Q 786 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.016

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）和Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）有雙向聯系[1]。1999年世界牙周病學研討會對牙周病進行重新分類，將伴發糖尿病的牙周疾病單獨命名，顯示了牙周病學界對糖尿病和牙周病關聯性的重視[2]。

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）是一氧化氮合成過程中的關鍵酶。NOS可分為內皮細胞型NOS（endothelial NOS，eNOS）、神經型NOS（neural

NOS，nNOS）和誘導型NOS（inducible NOS，iNOS）。eNOS主要存在于內皮細胞、血小板、中樞和外周神經細胞中，依賴于鈣離子或者鈣離子調節蛋白激活，起著維持細胞信號傳遞、調節血管緊張素及神經傳遞等重要生理功能。eNOS Glu298Asp基因多態性與牙周炎的炎癥程度有關。Kendall等[3]研究發現CP患

者eNOS 298T等位基因明顯高于正常對照組。研究發現：eNOS Glu298Asp基因多態性與Ⅱ型糖尿病[4]、Ⅱ型糖尿病患者的心血管疾病易感性相關[5]，也可

作為糖尿病腎病的遺傳標志[6]。

牙周炎與系統性疾病關系的研究是牙周病學研究的熱點之一，通過該研究期待對牙周炎有更進一步的認識，為其診斷和治療提供依據[7-9]。現階段對于eNOS與口腔疾病的研究甚少，國內外尚未見eNOS Glu298Asp基因多態性與糖尿病伴牙周炎關系的研究報道。本文旨在研究eNOS Glu298Asp基因多態性與糖尿病伴牙周炎易感性的關系，為進一步探討eNOS在牙周炎和Ⅱ型糖尿病中的相關作用和意義提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本試驗選取2009年3月—2010年12月在四川大學華西醫院內分泌科和體檢中心以及四川大學華西口腔醫院牙周科就診的漢族患者200例為研究對象，包括CP患者、CP伴T2DM患者、T2DM患者和牙周健康者。其中CP組男性25人，女性25人，年齡30～60歲，平均年齡為（45±4.6）歲；CP+T2DM組男性28人，

女性22人，年齡31～64歲，平均年齡為（43±3.8）歲；

T2DM組男性28人，女性22人，年齡31～64歲，平均年齡為（44±4.2）歲；正常組（H組）男性24人，女性26人，年齡30～63歲，平均年齡為（46±3.5）歲。CP患者

的納入標準：1）全口至少有10顆可進行牙周評價的牙齒，至少有4顆磨牙（不包括第三磨牙）；2）至少有3個象限內有1個或多個位點探診深度（probing depth，

PD）≥6 mm、附著喪失（attachment loss，AL）≥5 mm；3）X線片顯示牙槽骨吸收≥1/3[10]。凡符合CP診斷標準的漢族患者均納入為CP組。所選牙周炎患者均無糖尿病、心血管疾病和內分泌等系統性疾病。T2DM診斷標準按世界衛生組織1999年公布的糖尿病診斷值：空腹血糖濃度≥7.0 mmol·L-1，餐后2 h血糖濃度≥11.1 mmol·L-1，葡萄糖耐量試驗中2 h血漿葡萄糖水平≥11.1 mmol·L-1，有顯著的胰島素抵抗為主伴有胰島素相對不足，或有胰島素分泌不足為主伴有或不伴有胰島素抵抗所致的糖尿病；無其他系統性疾病的漢族患者納入。符合CP診斷標準又符合診斷標準的漢族患者納入CP+T2DM組。正常組參照Armitage等[10]的標準，要求牙周健康/齦炎，即口腔衛生情況良好，平均臨床牙周附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≤0.5 mm，鄰面沒有CAL≥3 mm的位點，失牙數≤2（系指除第三磨牙或正畸需要拔牙、外傷或者重度齲失牙及先天性缺牙外的失牙數），X線片顯示無牙槽骨吸收，全身健康，無系統性疾病。以上各組要求：1）年齡30～65歲，按性別、年齡配對；2）試驗前1個月內未服用過抗生素；3）試驗前6個月內未行牙周治療；4）無妊娠婦女；5）無吸煙（不吸煙或者戒

煙10年以上者）和飲酒等不良嗜好。所有研究對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集和DNA提取 用無菌棉簽取患者雙側頰黏膜拭子，室溫下自然干燥過夜，無菌密閉容器中保存。取頰黏膜拭子，剝取拭子表層加入1 000 μL無菌水的試管內，旋轉擰干拿出，12 000 r·min-1離心

5 min，棄上清液。加入5%Chelex-100液200 μL使其浸沒標本，再加入蛋白酶K（20 mg·mL-1）10 μL漩渦

振蕩混勻，55 ℃水浴3 h，煮沸8 min，-20 ℃保存。

1.2.2 eNOS Glu298Asp多態性目的基因的擴增和酶切 應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）檢測eNOS Glu298Asp的基因多態性。

引物（大連寶生物工程有限公司）序列為：上游引物5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3’，下游引物5’-CCCAGTCAATCCTTTGGTGCTCA-3’。PCR反應體系（25 μL）：DNA模板6 μL，2×Taq PCR Master-Mix 12.5 μL，上下游引物各1.25 μL，dd H2O 4 μL。吹打后輕彈管壁混勻，1 000 r·min-1瞬時離心。

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）循環參數：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析證實PCR擴增成功，取純化后的PCR產物，限制性內切酶Ban Ⅱ（成都寶信生物技術有限公司，目錄號N1215006）酶切，恒溫水浴箱37 ℃水浴過夜。酶切片段經2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后通過UV凝膠成像系統判定結果。

1.3 PCR質量控制措施

在盲法下測定所有標本，在單盲情況下隨機抽取10%樣本重復測定各位點基因型，以確保所測基因型的可靠性和重復性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件包對實驗數據進行分析，計數資料以率表示，根據Hardy-Weinberg平衡估計等位基因頻率，4組間基因型分布及等位基因頻率的比較采用行×列表?2檢驗，并計算比值比（OR）和95%可信區間（CI）。

2 結果

2.1 eNOS Glu298Asp多態性目的基因的擴增和酶切

分析

目的基因擴增片段長度為457 bp。根據限制性內切酶Ban Ⅱ酶切結果，GT型者（457、320、137 bp）為3條電泳帶；GG型者（320、137 bp）為2條電泳帶；TT型者（457 bp）為1條電泳帶。

本試驗中共有GG型43例，其中CP組19例，T2DM組2例，CP+T2DM組10例，H組12例；GT型110例，其中CP組22例，T2DM組36例，CP+T2DM組27例，H組25例；TT型47例，其中CP組9例，T2DM組12例，CP+T2DM組13例，H組13例。4組基因型的分布差異有統計學意義（?2=18.503，P=0.005）；等位基因頻率分布差異有統計學意義（?2=8.243，P=0.041），具體

見表1。

2.2 危險因素評估

2.2.1 CP+T2DM組與H組相比 CP+T2DM組與H組相比，T基因型的OR值為0.962，95%可信區間為0.737～1.256，說明T基因型可能為糖尿病和牙周炎的保護

因素，但差異無統計學意義。G基因型的OR值為1.043，95%可信區間為0.781～1.391，說明G基因型可能為糖尿病和牙周炎的危險因素，但差異無統計學意義。

2.2.2 T2DM組與H組相比 T2DM組與H組相比，T基因型的OR值為0.850，95%可信區間為0.662～1.091，說明T基因型可能為糖尿病的保護因素，但差異無統計學意義。G基因型的OR值為1.225，95%可信區間為0.896～1.674，說明G基因型可能為糖尿病的危險因素，但差異無統計學意義。

2.2.3 CP組與H組相比 CP組與H組相比，T基因型的OR值為1.275，95%可信區間為0.938～1.734，說明T基因型可能為牙周炎的危險因素，但差異無統計學意義。G基因型的OR值為0.817，95%可信區間為0.632～1.055，說明G基因型可能為牙周炎的保護因素，但差異無統計學意義。

3 討論

人類編碼eNOS基因位于染色體7q35～36，包含 26個外顯子和25個內含子，染色體全長21 kb，編碼含有1 203個氨基酸的蛋白質。目前發現eNOS主要的基因變異為第7外顯子處G894→T突變，導致其編碼的第298位氨基酸由谷氨酸（Glu）變成天冬氨酸（Asp），該變異與牙周炎及系統性疾病有關[11]。

本試驗總體結果顯示基因型GT>TT>GG，各基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，4組eNOS Glu298Asp基因型的分布差異有統計學意義（?2=18.503，P=0.005）。等位基因頻率分布差

異也有統計學意義（?2=8.243，P=0.041）。本實驗數據顯示T基因型可能是CP候選基因型，然而目前的研究尚未證明T基因型導致牙周炎的機制。T基因型可能與eNOS其他功能相關基因連鎖不平衡[12]，T基因可能是疾病連鎖易感基因，從而使病例組與對照組間產生假陽性。

有文獻報道：eNOS Glu298Asp的TT基因型占普通人群9%～13%[13]，而本實驗TT基因型占18%～26%，這可能與種族不同有關。Glu298Asp多態性是eNOS基因多態性中唯一編碼區基因突變且無沉默區突變。該基因突變與eNOS蛋白質、NO合成、內皮功能有重要關系，這可能暗示TT基因型可能導致內皮功能障礙，合成低水平NO[14-16]。eNOS Glu298Asp基因多態

性與糖尿病及牙周炎有關，致病機制可能為局部細胞因子過多，C反應蛋白、纖維蛋白原、白細胞數增加引起系統炎癥反應[6]。

筆者初步研究發現eNOS Glu298Asp基因多態性與CP以及CP伴T2DM相關。eNOS Glu298Asp的突變對CP、CP伴T2DM及糖尿病易感性的研究還需擴大樣本進一步的研究。它與T2DM、CP等疾病關系密切而且復雜，在發展過程中的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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（本文編輯 杜冰）