富血小板纖維蛋白與富血小板血漿體外釋放生長因子的比較及其對脂肪干細胞增殖分化的影響

[摘要] 目的 比較富血小板纖維蛋白（PRF）與富血小板血漿（PRP）體外釋放生長因子的質量濃度及其對脂肪干細胞（ADSCs）增殖和成骨分化的影響。方法 抽取兔耳中央動脈血，一次離心法制備PRF，二次離心法制備PRP，

分別將其置于5 mL新鮮的α-MEM培養液中，分別于37 ℃下靜置1、7、14、21、28 d，收集PRF與PRP析出液，檢測析出液中轉化生長因子-β1（TGF-β1）及血小板源性生長因子-AB（PDGF-AB）的質量濃度。將收集的PRF與PRP析出液配置成條件培養液培養ADSCs，觀察其對ADSCs增殖及堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。結果 1）生長因子釋放情況：不同時間點的PRF析出液中，14 d時TGF-β1的質量濃度達到最高，7 d時PDGF-AB的質量濃度最高；不同時間點的PRP析出液中，1 d時TGF-β1與PDGF-AB的質量濃度即達最高，以后逐漸下降。2）對ADSCs增殖及ALP活性的影響：PRF析出液中，14 d時對其影響最大；PRP析出液中，1 d時對其影響最大。結論 與PRP相比，PRF能夠緩慢持久地釋放生長因子，更有力地刺激ADSCs的增殖和分化。

[關鍵詞] 富血小板纖維蛋白； 富血小板血漿； 脂肪干細胞； 成骨分化

[中圖分類號] R 783 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.019

口腔種植技術已經廣泛用于缺失牙及牙列的修復中，種植體與骨之間如何能達到穩定的骨結合一直是研究的熱點。從人血液中提取的富血小板血漿

（platelet-rich plasma，PRP）富含多種生長因子，可以促進組織再生[1]。目前有許多學者將其用于口腔

種植研究中，但效果差異較大。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是一種區別于傳統PRP技術的富含細胞因子和生長因子的新一代血小板濃縮物，于2001年由Choukroun等[2]提取出來，因此又稱

為Choukroun’s PRF。PRF的分子結構類似于天然血凝塊，可以借助細胞因子的調節作用以及纖維蛋白的支架作用進行組織修復[3]。與PRP比較，PRF制備時無需添加任何生物制劑，同時還具有促進成骨及炎癥調節的能力，能夠獨立應用以修復小范圍的骨缺損，也可以與骨移植材料聯合應用進行大范圍骨缺損的修復。但是目前對PRF和PRP釋放細胞因子的情況，以及對靶細胞作用效果的差異的研究還較少，本研究主要對不同時間點提取的PRF和PRP析出液中生長因子的質量濃度進行測定，并探討二者對脂肪干細胞（adipose tissue-derived stem cell，ADSCs）增殖分化的影響，以便為臨床及組織工程研究選擇合適的支架材料提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

高糖α-MEM培養液、胎牛血清（fetal bovine se-rum，FBS）、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（Gibco公司，美國），堿性磷酸酶（alkaline phospha-

tase，ALP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）、血小板源性生長因子-AB（platelet derived growth factor-

AB，PDGF-AB）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked

immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、轉化生長因

子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA試劑盒（上海希美生物科技有限公司）。

1.2 原代細胞的培養

無菌切除兔腹股溝處的脂肪組織，D-hanks液沖洗3次。在超凈工作臺上用無菌剪將其剪成乳糜狀后收集于離心管中，加入2倍體積的質量濃度為3 g·L-1的Ⅰ型膠原酶，置37 ℃恒溫搖床上振蕩消化30 min，然后加入等體積的含10%FBS的α-MEM培養液終止消化。200目濾網過濾后1 000 r·min-1離心5 min，傾去上層殘余脂肪以及上清液，用含10%FBS的α-MEM培養液重懸細胞，接種在培養瓶中，置于37 ℃含5%CO2的培養箱中靜置培養，24 h后細胞貼壁，換液，以后每3天換液1次。每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長形態，待細胞長滿80%時，0.5 g·L-1胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養，取第3代細胞用于實驗。

1.3 ADSCs的鑒定

采用多向誘導分化（成脂和成骨誘導）的方法鑒

定ADSCs。

成脂誘導方法如下。細胞長滿培養瓶底后，常規消化并收集細胞，將細胞以每毫升2.1×104個細胞的密度接種于6孔板中，置于細胞培養箱中培養，常規換液。當細胞完全融合后棄培養液，更換成脂誘導液a（含α-MEM培養液、青霉素、鏈霉素、1 μmol·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-1 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200 μmol·L-1吲哚美鋅、10 μg·mL-1胰島素），誘導3 d后，棄去誘導液a，更換為保持液b（含α-MEM培養

液、青霉素、鏈霉素、10 μg·mL-1胰島素），1 d后再次換為誘導液a誘導。誘導順序為：誘導3 d、保持

1 d，如此重復4次，最后誘導5 d。誘導21 d后，進行油紅O染色。

成骨誘導方法如下。待培養的ADSCs達到80%融合時，常規消化收集細胞。將細胞接種于6孔板中，每孔的細胞密度為每毫升1×104個，加入2 mL細胞培養液置于細胞培養箱中培養，24 h后棄培養液，每孔加入2 mL成骨誘導液（含α-MEM培養液、0.1 μmol·L-1地塞米松、50 mg·L-1維生素C、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸鈉）進行誘導，每3 d換液1次，誘導21 d后進行茜素紅染色。

1.4 PRF與PRP析出液的制備

PRF制備：無菌抽取兔耳中央動脈血10 mL至真空負壓管中，立即于3 000 r·min-1離心15 min，兔血可分為3層，最底層為紅細胞層（red blood cells，RBC），表層為貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）層，中間層即為PRF。

PRP制備：無菌抽取兔耳中央動脈血10 mL至含枸櫞酸鈉抗凝劑的負壓管中，1 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液及交界面下1～2 mm深的紅細胞至另一個離心管內，3 000 r·min-1離心8 min，棄去上清液的上3/4，輕輕振蕩后即為PRP。將PRP與凝血劑（含10%氯化鈣和1 000 U凝血酶）混合后搖勻，PRP即被激活呈凝膠狀。

將制備好的PRF與PRP分別置入含5 mL α-MEM培養液的離心管中，37 ℃條件下靜置，于1、7、14、21、28 d時收集PRF和PRP析出液，在每個時間點取出析出液后，再于離心管中加入5 mL新鮮的α-MEM培養液，待下一個時間點收集析出液。實驗前將收集的析出液-80 ℃保存備用。

1.5 TGF-β1與PDGF-AB質量濃度的測定

使用ELISA試劑盒對PRF和PRP析出液中TGF-β1與PDGF-AB的質量濃度進行檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 ADSCs增殖的檢測

取生長良好的第3代ADSCs，以每孔1.5×104個細

胞的密度接種于7塊48孔板中，24 h后換液，用無血清培養液培養24 h，使細胞狀態同步化。細胞分為12組，分別使用不同的培養液進行培養，即陽性對照組、實驗組（PRF1、PRF7、PRF14、PRF21、PRF28、PRP1、PRP7、PRP14、PRP21及PRP28）以及陰性對照組。陽性對照組使用含10%FBS的α-MEM培養液培養（含10%FBS、100 U·mL-1鏈霉素、100 U·mL-1青霉素），陰性對照組使用無血清的α-MEM培養液培養，其余10組分別使用不同時間點PRF和PRP（分別為1、7、14、21、28 d）析出液配制α-MEM培養液

培養（含體積分數10%PRF或PRP析出液、100 U·mL-1

鏈霉素、100 U·mL-1青霉素），每組分別追加3個復孔，培養1～7 d。

每日選擇1個孔板對12組不同培養條件下的細胞進行消化，分別用血球計數板在倒置顯微鏡下進行計數，取其均數，操作重復3次。以時間（d）為橫坐標，細胞計數為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

1.7 ALP活性檢測

取生長良好的第3代ADSCs，以每孔1.5×104個細胞的密度接種于48孔板中，24 h后換液，用無血清培養液培養24 h，使細胞狀態同步化。細胞分為12組，同1.6。陽性對照組使用含10%FBS的α-MEM成骨誘導液培養（含10%FBS、0.1 μmol·L-1地塞米松、

50 mg·L-1維生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉），陰性對照組使用無血清的α-MEM成骨誘導液培養，其余10組使用不同時間點PRF和PRP析出液配制α-MEM成骨誘導液培養（含體積分數10%PRF或PRP析出液、

0.1 μmol·L-1地塞米松、50 mg·L-1維生素C、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸鈉）。連續培養7 d，常規換液。

培養7 d后，棄培養液，PBS漂洗細胞，每孔加入150 μL的1%TritonX-100，冰上裂解10 min，顯微鏡觀察細胞破碎情況，收集細胞并離心，用微量移液器吸取上清，按照ALP操作試劑盒進行檢測，酶標儀下測定光密度（optical density，OD）值，波長520 nm。按試劑盒提供的公式計算ALP活性，實驗重復3次。

1.8 統計分析

使用SPSS 11.0軟件進行統計學分析，樣本用x±s表示，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 ADSCs鑒定結果

ADSCs的成脂、成骨誘導結果見圖1、2。成脂誘導3 d左右，細胞形態由長梭形變為類圓形，與脂肪細胞相似，部分細胞的細胞質內出現折光性強的小液滴；持續成脂誘導，液滴的數量增多，且融合成大液滴；誘導3周后進行油紅O染色，可見細胞質中的液滴被染為紅色，即為脂滴（圖1）。成骨誘導3～4 d，細胞形態發生改變，由長梭形變為三角形或多邊形，類似成骨細胞的形態；誘導7 d左右可見少量細胞外基質沉淀，誘導時間越長，沉淀越明顯；誘導3周后進行茜素紅染色，可見鈣結節形成（圖2）。

2.2 TGF-β1與PDGF-AB的質量濃度

不同時間點PRF和PRP中TGF-β1和PDGF-AB的質量濃度見表1。PRF中，TGF-β1的質量濃度隨靜置時間的增加而逐漸升高，PRF14組達到高峰，其后下降；PDGF-AB的質量濃度亦隨靜置時間的增加而升高，PRF7組達到高峰，其后下降。PRP中，TGF-β1和PDGF-AB的質量濃度在PRP1組均最高，其后隨靜置時間增加而下降。經統計學檢驗，PRP中TGF-β1和PDGF-AB的質量濃度除了PRP1組高于同時間點的PRF1組外，其余時間點均低于相應的PRF組（P<

0.05）。

2.3 PRF與PRP對ADSCs增殖作用的影響

12組ADSCs細胞的生長曲線見圖3。PRF組中，PRF14組的ADSCs增殖程度高于其余PRF組、陰性對照組和陽性對照組（P<0.05）；PRP組中，PRP1組的

ADSCs增殖程度高于其余PRP組、陰性對照組和陽性

對照組（P<0.05）。在同一時間點相比，PRF7、PRF14

組的ADSCs增殖程度均分別高于PRP7、PRP14組，PRP1組的ADSCs增殖程度高于PRF1組，上述差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.4 ALP活性檢測結果

培養7 d后，陽性對照組和陰性對照組的ALP活性分別為4.479±0.326和3.363±0.127，PRF和PRP各組的ALP活性檢測結果見表2。

PRF14和PRP1組的ALP活性最高，且兩者之間無明顯差異（P>0.05）；PRF14組ALP活性高于其余PRF組、陽性對照組和陰性對照組；PRP1組的ALP活性高于其余PRP組、陽性對照組和陰性對照組（P<0.05）；同一時間點相比，PRP1組的ALP活性高于PRF1組，PRF14組高于PRP14組，其差異均具有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

PRP中富含多種生長因子，其生長因子來源于血小板，但它在促進組織修復中的作用備受爭議。研究[4-5]表明，PRP形成的凝膠塊中所含有的血小板以

及生長因子的作用時間僅限于早期階段，不可能作用于組織修復的全部過程。Choukroun’s PRF技術的操作簡單且成本低廉，被稱為第2代血小板濃縮物[6]。

PRF具有良好的促進軟硬組織再生的作用[7-8]，近年

來PRF已經初步應用于口腔種植領域中。與PRP相比，PRF更注重纖維蛋白的作用，其內的纖維蛋白能將血小板和釋放的生長因子以化學鍵結合，通過緩慢釋放，延長生長因子的作用時間[6]。本研究檢測了PRF與PRP在不同時間點釋放的TGF-β1與PDGF-AB的質量濃度，發現PRF中TGF-β1與PDGF-AB的質量濃度隨時間的延長而增加，TGF-β1在14 d時最高，PDGF-AB在7 d時最高，其后逐漸減少；相反，PRP中TGF-β1與PDGF-AB均在第1天時質量濃度最高，隨后迅速下降。此結果進一步證實了PRF可以緩慢釋放生長因子的結論。PRF中的血小板像黏結劑一樣浸入到纖維蛋白網內，其中的白細胞具有活性并且可以在密集的纖維蛋白網狀結構中產生作用[9]。PRF與PRP促進ADSCs增殖和分化的作用有賴于其中的TGF-β1與PDGF-AB。本實驗測定了PRF和PRP對ADSCs增殖分化的作用，結果發現：PRP組中，ADSCs的細胞增殖活性及ALP活性均在早期階段較高，隨時間的延長而降低；PRF組中，ADSCs的細胞增殖活性及ALP活性隨時間的延長逐漸增高，14 d達到最高，其后下降。該結果與細胞因子的檢測結果類似。由此可以推測，與PRP相比，PRF可以明顯延長對組織修復的效果。PRP的作用在早期階段最強，可能是以往的研究中其成骨效果差異較大的原因之一，因為其成骨作用不能作用于組織修復的全過程。

與PRP相比，PRF制備簡單且操作容易，已經作為一種新型的自體材料初步應用于口腔種植臨床中[10-11]。本實驗進一步表明了PRF能緩慢持久地釋放生長因子，可更加有效地促進ADSCs的增殖和分化，為PRF的臨床應用及組織工程學研究提供了新思路。

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（本文編輯 吳愛華）