活化Notch2信號促進高糖條件下破骨細胞分化的體外研究

[摘要] 目的 探討活化Notch2信號對高糖條件下核因子κB受體活化因子配體（RANKL）誘導破骨細胞分化的影響，

初步明確Notch2信號在高糖條件下破骨細胞分化中的作用。方法 體外培養小鼠破骨前體細胞，在高糖條件下采用RANKL刺激破骨前體細胞。實驗分為葡萄糖和甘露醇等滲對照組，每組設5個濃度（0、5、10、20、40 mmol·L-1），

通過實時定量聚合酶鏈反應檢測Notch2基因的表達水平，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色檢測破骨細胞分化情況。構建含Notch2細胞內片段（ICN2）的病毒載體（pMX-ICN2），轉染包裝細胞，收獲病毒上清液感染破骨前體細胞；將病毒載體分為ICN2-OE（ICN2過表達）和EMPTY（僅感染pMX載體）兩組，通過蛋白質印跡法檢測ICN2蛋白的表達水平；并在高糖條件下（20、40 mmol·L-1）用RANKL刺激ICN2-OE和EMPTY組，設甘露醇等滲對照組，用TRAP染色檢

測破骨細胞分化情況。結果 RANKL誘導破骨細胞分化過程中，葡萄糖濃度為20、40 mmol·L-1時，破骨細胞數分別為110.3±6.8和72.0±8.0，Notch2相對表達量分別為1.65±0.23和1.10±0.11；20、40 mmol·L-1甘露醇組的破骨細胞數分別為152.7±7.0和157.0±12.5，Notch2相對表達量分別為2.82±0.28和2.42±0.27，組間差異有統計學意義（P<0.05）。

活化Notch2信號后，葡萄糖濃度為20、40 mmol·L-1時，ICN2-OE組破骨細胞數分別為206.7±7.8和178.3±11.5，EMPTY組分別為102.3±8.7和76.0±10.1，組間差異有統計學意義（P<0.05）。結論 活化Notch2信號可促進高糖條件下破骨

細胞的分化。

[關鍵詞] Notch2信號； 高糖； 破骨細胞分化

[中圖分類號] Q 25 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.007

研究[1-2]發現：破骨細胞不僅是唯一能進行骨吸收的細胞，而且是參與牙槽骨組織改建的主要功能細胞。破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，由單個核前體細胞融合而成。在破骨前體細胞向破骨細胞分化過程中，不僅受到包括核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）激活的Notch2在內的多種信號傳導通路的調控[3-4]，而且受到包括血糖濃度在內的多種微環境因素的調控[5]。目前，有關Notch2信號在高糖條件下對破骨細胞分化情況的影響還不清楚。因此，探討高糖條件下活化Notch2信號對破骨細胞分化的影響，不僅可以明確Notch2信號在糖尿病狀態下牙槽骨改建中的作用，并且可以為尋找糖尿病性牙周炎的治療方法提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

293T細胞；α-MEM、DMEM、特級胎牛血清、聚凝胺（polybrene）（Sigma公司，美國），RANKL、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美國）；pMXs（Cell Biolabs公司，美國）；LipofectamineTM 2000、TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國），SYBR GREEN試劑盒（Takara公司，日本），Notch2細胞內片段（intracellu-lar fragment of Notch2，ICN2）抗體（Cell Signaling公司，美國），T-PER組織蛋白提取試劑和BCA蛋白分析試劑（Pierce公司，美國）；聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene difluoride，PVDF）膜（Millipore公司，德國）。

1.2 細胞培養

取4周齡SD雄性大鼠，斷頸處死，無菌條件下分離完整的股骨和脛骨，暴露髓腔后用α-MEM培養基（含10%胎牛血清）沖洗骨髓腔數次至骨干發白為止，然后接種于10 cm大小的培養皿中，在標準條件（飽和濕度、5%CO2、37 ℃）下培養12 h后收集非貼

壁細胞，1 500 r·min-1（離心半徑15 cm）、37 ℃離心

5 min，棄上清液，視為破骨前體細胞[3]，加入M-CSF

（20 ng·mL-1）和RANKL（30 ng·mL-1）誘導其向破骨細胞分化。293T細胞用DMEM培養液培養。

1.3 高濃度葡萄糖刺激

按照濃度依次增高的順序，設置0、5、10、20、

40 mmol·L-1共5個葡萄糖梯度，同時設置相對應的0、5、10、20、40 mmol·L-1甘露醇梯度，作為等滲對照。

1.4 含ICN2基因的逆轉錄病毒載體pMX-ICN2載體

的構建

設計引物5’-CGGGATCCGGTCATCATGGCCAA-

3’和5’-GCGAATTCCACCTGCATGTTGCTGTG-3’，

通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增針對小鼠Notch2基因細胞內片段ICN2的DNA片段，經雙酶切（BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ）后連接到pMX載體，構建pMX-ICN2載體，并行Xba Ⅰ酶切以及DNA測序鑒定。

1.5 體外基因轉染和病毒感染

以每毫升5×105個細胞的密度接種293T細胞于

6 cm培養皿內，培養12 h。用LipofectamineTM 2000分別將pMX-ICN2或pMX載體轉染293T細胞，轉染24 h后更換新鮮培養基，加G418（400 μg·mL-1）進行抗性篩選。2周左右形成抗性集落后收集病毒上清液，用0.45 μm濾器過濾，分裝后于-70 ℃凍存備用。破骨前體細胞（每孔3×106個細胞）接種于6孔板培養12 h，加入重組逆轉錄病毒上清液和完全培養基，并加入聚凝胺至終質量濃度為8 μg·mL-1，然后用ICN2抗體進行蛋白質印跡檢測以測定ICN2蛋白表達水平，其中ICN2高表達組為Notch2信號活化組，命名為ICN2-OE，而感染pMX組為對照組，命名為EMPTY。

1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid pho-

sphatase，TRAP）染色

將在高糖或等滲甘露醇培養條件下受RANKL誘導的破骨前體細胞、ICN2-OE及EMPTY，用PBS洗2次，4%甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗2次，甲醇和丙酮混合液（體積比1∶1）固定3～5 min，PBS洗2次，37 ℃條件下用TRAP染色液染色10 min，雙蒸水洗3次，光鏡觀察并計數破骨細胞。多核（細胞核數目≥3個）且TRAP染色陽性的細胞視為破骨細胞。

TRAP染色液配方：N，N-二甲基甲酰胺500 μL、磷酸萘酚5 mg、TRAP緩沖液50 mL、固紅紫色LB磷酸鹽30 mg；其中TRAP緩沖液配制方法為：醋酸1 mL、三水合乙酸鈉6.8 g、酒石酸鈉二水11.5 g，加雙蒸水溶解至1 000 mL。

1.7 RNA的提取、cDNA制備及實時定量PCR分析

將高糖或等滲甘露醇培養條件下，受RANKL誘導的破骨前體細胞，用TRIzol試劑一步法抽提細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA260 nm/RNA280 nm吸光度值以檢測RNA樣品的純度和濃度；然后按FERMEN-TAS逆轉錄試劑盒標明的操作步驟進行實時定量PCR，cDNA合成在42 ℃進行60 min，70 ℃滅活5 min。用SYBR GREEN試劑盒進行實時定量PCR分析。利用Primer Express 2.0設計針對Notch2基因與內參照β-

actin的引物如下：小鼠Notch2正義鏈5’-CCCCTTGC-CCTCTATGTACCA-3’，反義鏈5’-GGTAGGTGGGA-AAGCCACACT-3’，擴增產物長度為67 bp；β-actin正義鏈5’-TGAGAGGGAAATCGTGCGT-3’，反義鏈

5’-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-3’。利用2-ΔΔCT公式計算Notch2相對于β-actin的基因表達量。

1.8 ICN2表達的蛋白質印跡法分析

用細胞裂解液[含1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物

（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）]裂解ICN2-OE和EMPTY細胞，冰上孵育20 min后，10 000 r·min-1離心（半徑10 cm）5 min，保留上清液。測定蛋白質質量濃度后，每種樣品以20 μg上樣，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sul-fate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后轉移到PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBS（含

20 mmol·L-1 Tris、100 mmol·L-1 NaCl，pH值為7.6）中封閉1 h。ICN2多克隆抗體一抗于4 ℃下孵育12 h，二抗于室溫下孵育1 h，ECL試劑盒顯影，行光密度掃描作為蛋白質的定量指標。

1.9 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計，各組數據采用x±s表示，采用單因素方差分析進行多個樣本均數間比較，組間比較用SNK方法。檢驗水準為單側α=0.05。

2 結果

2.1 高濃度葡萄糖抑制RANKL誘導的破骨細胞分化

破骨細胞的TRAP染色情況見圖1，其計數情況見表1。圖1中箭頭所示為多核且TRAP染色為陽性的破骨細胞。從表1中可以看出：隨著甘露醇濃度的升高，各組間破骨細胞數量的差異無統計學意義（P>

0.05）；葡萄糖濃度分別為5、10 mmol·L-1時與等滲甘露醇組間的差異無統計學意義（P>0.05），隨著葡萄

糖濃度的繼續升高，破骨細胞數目減少，葡萄糖濃度為20、40 mmol·L-1時與等滲甘露醇組間的差異具有統計學意義（P<0.05）。該結果提示，高糖環境可

以抑制RANKL誘導的破骨細胞分化。

2.2 高濃度葡萄糖抑制Notch2受體表達

實時定量PCR分析Notch2受體mRNA的表達情況見表2。從表2中可以看出：隨著甘露醇濃度的升高，各組間Notch2受體表達的差異無統計學意義（P>0.05）；葡萄糖濃度分別為5、10 mmol·L-1時與等滲甘露醇組間表達的差異無統計學意義（P>0.05），隨著葡萄糖濃度的繼續升高，Notch2受體表達逐漸降低，葡萄糖濃度為20、40 mmol·L-1時與等滲甘露醇組間的差異具有統計學意義（P<0.05）。該結果提示高糖環境可以抑制RANKL誘導的Notch2受體表達。

2.3 活化Notch2信號促進高糖環境下RANKL誘導的

破骨細胞分化

pMX-ICN2表達載體經Xba Ⅰ酶切，得到預期大小分別為1 587、2 619、4 299 bp的片段，結果如圖2所示，初步表明逆轉錄病毒載體pMX-ICN2構建成功。對DNA測序結果進一步分析表明此重組表達載體構建正確。從圖3中可看出：與EMPTY組（感染pMX空載體病毒上清液）細胞相比，ICN2-OE的ICN2表達水平升高，該結果提示Notch2信號被活化。從表3中可以看出：活化Notch2信號后，甘露醇濃度為20、40 mmol·L-1時，ICN2-OE組破骨細胞數量多于EMPTY組，兩組間的差異有統計學意義（P<0.05）；

葡萄糖濃度為20、40 mmol·L-1時，ICN2-OE組破骨細胞數量多于EMPTY組，兩組間的差異具有統計學意義（P<0.05）；但是在20、40 mmol·L-1時，ICN2-OE組破骨細胞數量少于對照組（等滲甘露醇濃度組），且二者間的差異具有統計學差異（P<0.05）。該結果提示

活化Notch2信號不但可以促進高滲狀態下RANKL誘導的破骨細胞分化，而且可以促進高糖環境下RANKL誘導的破骨細胞分化，但活化Notch2信號不能夠完全阻止高糖對破骨細胞分化的抑制作用，說明可能有多種信號途徑參與了高糖抑制破骨細胞分化的過程。

3 討論

國內外有關高糖刺激對體外破骨細胞分化影響的研究結果仍不一致。一方面，有研究[5]表明高濃度

葡萄糖通過提高破骨前體細胞表面核因子κB受體（re-ceptor activator of nuclear factor kappa B，RANK）的表達水平，從而促進RANKL誘導破骨細胞的分化及其骨吸收功能；另一方面，也有研究[6]表明高濃度

葡萄糖通過降低細胞核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活性而抑制破骨細胞分化。

破骨前體細胞在向破骨細胞分化的過程中，受到多種信號通路的精確調控以及所處微環境的綜合影響。破骨前體細胞向破骨細胞分化及其骨吸收過程中，需要葡萄糖作為基本的能量代謝物質。根據預實驗結果和以往的文獻報道[7]，人體內正常血糖濃

度大約為5.5 mmol·L-1，本實驗選擇葡萄糖濃度為5、

10、20、40 mmol·L-1的α-MEM培養基培養破骨前體細胞。從本實驗的研究結果可以看出，各組均有破骨細胞形成，隨著葡萄糖濃度的升高，多數實驗組破骨細胞的數量少于等滲對照組，二者間差異具有統計學意義。這說明RANKL能誘導破骨前體細胞向破骨細胞分化，而高糖環境可以抑制破骨細胞分化，并且呈現出濃度依賴性，總體趨勢是濃度越大，抑制破骨細胞分化的能力越強。

破骨細胞分化的機制是一種復雜的多水平調控機制[8-9]，多因素相互作用可以促進或抑制破骨細胞的分化。對破骨細胞分化調控機制的探討是國內外的研究熱點。Notch信號是細胞與細胞之間直接作用的主要信號通路之一，參與調控細胞的增殖、分化等生物學過程。經典Notch信號通路由受體配體相互作用后，導致Notch受體胞內段ICN從膜上釋放，ICN進入細胞核，將與DNA結合的抑制蛋白轉化為轉錄激活因子，激活下游靶基因的表達[10]。Notch信號通路的關鍵核轉錄因子RBP-J和NF-κB通過競爭性與活化T細胞核因子1（nuclear factor of activated T-cell 1，

NFATc1）啟動子區域結合，在RANKL誘導破骨細胞分化過程中發揮重要的調控作用[3]。利用γ-分泌酶抑

制劑阻斷Notch信號或是通過shRNA干擾阻斷Notch2信號可抑制RANKL誘導的破骨細胞的分化過程，而活化Notch2信號可促進RANKL誘導的破骨細胞分化過程。由于破骨前體細胞主要表達Notch2受體[3]，提

示Notch信號的綜合效應可能為正向調控RANKL誘導破骨細胞分化過程。本實驗結果提示，隨著葡萄糖濃度的升高，實驗組細胞表面Notch2受體的表達水平低于對照組，二者之間差異具有統計學意義。這說明RANKL能提高細胞表面Notch2受體的表達水平，而高糖環境可以抑制Notch2受體的表達，提示Notch2信號可能參與調控高糖環境下RANKL誘導的破骨細胞分化過程。

目前，Notch2信號在高糖狀態下，對破骨細胞分化的調控作用還少有研究。已有研究表明，外源性Notch分子胞內區組成性活化形式ICN的表達與Notch配體激活Notch受體后對靶細胞的作用相類似，外源性ICN基因在靶細胞持續表達導致Notch信號過度活化[11-12]。因此，本實驗研究通過逆轉錄病毒系統將具

有Notch2活性的胞內片段ICN2導入破骨前體細胞，觀察高糖條件下，活化Notch2信號對破骨細胞分化的影響。本實驗結果提示，活化Notch2信號后，在相同的葡萄糖濃度下，實驗組破骨細胞的數量多于對照組（轉染空載體），二者間差異具有統計學意義。

該結果說明激活Notch2信號能促進高糖條件下破骨細胞的分化，提示Notch2信號可能正向調控高糖環境下破骨細胞的分化過程。結合考慮高糖抑制NF-κB活性的研究結果，Notch2信號可能與NF-κB具有協同作用，可見高糖作用下破骨細胞的分化機制相當復雜，除上述因素外，還有其他信號參與其中。

致謝：感謝日本福岡齒科大學分子生物學系岡部幸司教授在本課題實施中給予的大力幫助！

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（本文編輯 吳愛華）