體外成牙環境對牙髓干細胞和外胚間充質干細胞分化的影響

[摘要] 目的 利用牙胚細胞（TGC）作為誘導成牙環境，將牙髓干細胞（DPSC）、外胚間充質干細胞（EMSC）分別與其共培養，觀察DPSC和EMSC的分化能力。方法 利用出生后4 d的大鼠TGC作為誘導成牙環境，將培養的DPSC、EMSC使用BrdU標記及鑒定后與其共培養，免疫熒光雙標檢測標記細胞表面抗原牙本質涎蛋白（DSP）的表達和堿性磷酸酶（ALP）活性的變化，免疫組化染色鑒定及圖像分析DPSC、EMSC在成牙環境中的分化能力。結果 共培養7 d后，EMSC共培養組DSP陽性細胞的轉化率高于DPSC共培養組（P<0.05）。免疫組化染色圖像分析結果表明共培養7 d后，共培養組與TGC單獨培養組差異顯著（P<0.05）。共培養組3、7 d后ALP活性明顯增高，EMSC共培養組較DPSC

共培養組ALP活性高。結論 混合培養的TGC作為誘導細胞分化的微環境與DPSC、EMSC共培養后，能夠誘導細胞向成牙本質細胞分化，EMSC分化能力高于DPSC。

[關鍵詞] 牙胚細胞； 牙髓干細胞； 外胚間充質干細胞； 細胞分化

[中圖分類號] Q 254 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.005

成體干細胞的增殖和分化離不開特定的微環境，微環境中的間質細胞能夠產生一系列生長因子或配體，與干細胞相互作用，控制干細胞的更新和分化。現有研究表明在不同的誘導條件下干細胞有向不同細胞分化的潛能，從而將其作為種子細胞參與組織的損傷與修復。牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）、外胚間充質干細胞（ectoblast mesenchyme

stem cell，EMSC）都屬于牙源性的間充質干細胞，它們在一定成牙誘導環境中的細胞表型及功能變化，對于組織工程化牙齒構建中種子細胞的篩選具有重要的意義。本研究利用出生后4 d的大鼠牙胚細胞（tooth

germ cell，TGC）作為誘導成牙環境，將DPSC、EMSC與其共培養，觀察DPSC、EMSC對牙本質特異性蛋白牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）的表達及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的變化，觀察DPSC、EMSC在成牙環境中的分化能力，為今后組織工程化牙齒的構建提供有益的探索。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

K-SFM無血清培養液、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、牛垂體提取物（bovine pituitary extract，BPE）、抗角蛋白多克隆抗體（Gibco公司，美國），25 g·L-1 Brdu（Sigma公司，美國），抗Brdu單克

隆抗體（武漢博士德公司），抗牙本質涎蛋白多克隆抗體（Santz Cruz公司，美國），熒光二抗：異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗鼠IgG、羅丹明（TRITC）標記的山羊抗兔IgG（DAKO公司，美國），激光掃描共聚焦顯微細胞儀（奧林巴斯公司，日本），ALP試

劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 組織塊酶解法培養TGC 在體視顯微鏡下，分離出SD仔鼠（出生4 d）下頜骨第一磨牙牙胚（組織塊為1 mm3），絞碎后放入37 ℃ PBS緩沖液中，Ⅰ型膠原酶和Dispase消化，分離碎屑，離心后用無血清K-SFM培養液洗滌1次，離心并用含0.15 ng·mL-1 EGF、25 μg·mL-1 BPE的K-SFM無血清培養液將其制成細胞懸液，轉入培養瓶中，37 ℃、5%CO2孵箱中培養，每日換液。用細胞角蛋白多克隆抗體染色進行鑒定。

1.2.2 DPSC和EMSC的BrdU標記及鑒定 將DPSC和EMSC分別接種于6孔板內，板內預先放置細胞爬片，當細胞鋪滿瓶底60%時，加入BrdU溶液分別孵育48 h。取出玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛液固定30 min，然后進行免疫組化染色鑒定。

1.2.3 TGC與DPSC、EMSC直接接觸共培養 根據預實驗結果，將標記好的DPSC、EMSC分別與牙胚細胞以1∶1的比例混合接種于6孔板內。

1.2.4 免疫熒光雙標檢測標記細胞表面抗原DSP的表達 取共培養1、3、7 d的細胞進行免疫熒光雙標檢測，采用共聚焦顯微鏡進行觀察。分別以546 nm和490 nm波長的激發光觀察切片TRITC和FITC所標示的抗原（TRITC陽性細胞呈紅色，FITC陽性細胞呈綠色）；陰性對照采用一抗添加PBS。每張爬片隨機選取8～10個不同的視野，分別計數每個視野內的細胞數及標記細胞的DSP陽性細胞數，計算各個視野陽性細胞數與細胞總數的比值，取其均值，即為細胞的轉化率。

1.2.5 共培養細胞的免疫組化染色鑒定 對共培養的細胞同時使用LSAB組化試劑盒檢測DSP表達。

1.2.6 圖像分析 將免疫組化結果進行圖像分析，檢測DSP的表達變化。應用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統，將染色的細胞爬片在鏡下統一放大3.3×40倍，選取3張爬片，每張爬片隨機選取不相重疊的5個視野，用鼠標描繪所測細胞胞漿區域，計算機自動進行測量，獲得每張爬片的胞漿平均灰度值，并對所測數據進行統計分析。

1.2.7 ALP活性檢測和染色 將DPSC、EMSC分別與牙胚細胞以1∶1的比例混合接種于96孔板內，分別于培養后1、3、7 d后棄去培養基，依照ALP試劑盒操作說明檢測ALP活性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行分析，所有數據以x±s表示，多組均數比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGC的形態學觀察和鑒定

培養3～4 d后，細胞從小的組織塊爬出，部分細胞為橢圓、圓球型，胞漿豐富，胞核呈圓形，居中，有似鋪路石樣上皮細胞，連成片狀簇狀生長。周邊有大量呈多角形或梭形的成纖維樣間充質細胞生長（圖1）。行細胞角蛋白多克隆抗體染色后，部分細胞顯示紅色熒光（圖2）。

2.2 BrdU標記的干細胞

在綠色熒光激發下2種干細胞中大部分細胞核呈綠色熒光。免疫組化染色顯示大部分細胞胞核陽性著色，標記成功（圖3）。

2.3 共培養組細胞的形態學觀察

共培養后的細胞形態變化不明顯，DPSC共培養組部分細胞有一側胞漿突起；EMSC共培養組細胞呈

梭形，為成纖維樣形態。DPSC和EMSC與TGC間有比較明顯的界限，細胞間未見融合現象（圖4）。

2.4 共培養組細胞DSP抗原的表達

熒光共聚焦顯微鏡下觀察可見，在綠色熒光激發下，體外DPSC和EMSC共培養組在3、7 d后，都出現部分細胞核呈現綠色熒光；在紅色熒光激發下，部分細胞胞漿呈紅色著色。二者可表達于同一個細胞（圖5、6）。共培養1、3、7 d后，DPSC共培養組DSP陽性細胞的轉化率分別為1.01%±0.14%、12.63%±0.16%、23.56%±0.19%；EMSC共培養組DSP陽性細

胞的轉化率分別為1.65%±0.01%、19.62%±0.12%、36.52%±0.26%。共培養7 d后，EMSC共培養組轉化率較高（P<0.05）。

2.5 免疫組化染色和圖像分析結果

共培養后不同時間點兩組細胞均有陽性細胞，胞核未著色，胞漿呈棕黃色。共培養1 d時，EMSC共培養組陽性細胞數量與TGC單獨培養組差異不大，7 d時部分細胞呈陽性。共培養1 d時，DPSC共培養組只有少數細胞呈弱陽性或陰性，3 d時細胞為陰性或弱陽性，7 d時陽性細胞增多（圖7）。

免疫組化染色圖像分析結果見表1。由表1可見，共培養1 d后，3組細胞中DSP的陽性表達都較低，3 d后共培養組與TGC單獨培養組有差異，但是7 d后差異有統計學意義（P<0.05），DPSC共培養組和EMSC共培養組間差異無統計學意義（P>0.05）。

2.6 ALP活性檢測結果

共培養3、7 d后，ALP活性明顯增高，EMSC共培養組較DPSC共培養組ALP活性高（表2）。

3 討論

本實驗利用組織塊酶解法將SD大鼠牙胚組織進行混合培養，觀察到部分細胞呈現上皮樣細胞形態，呈橢圓形或圓球型。大部分細胞呈現成纖維樣細胞形態，呈梭形或不規則的多角形。免疫熒光顯示部分細胞對于上皮細胞的表面標志角蛋白染色陽性，表明混合培養的細胞中包含有上皮細胞的成分。

BrdU用于標記增殖分裂的細胞，其主要優點是BrdU抗體與BrdU反應后顯色可即刻顯現標記的情況[1]。本研究利用BrdU標記共培養的DPSC和EMSC，免疫組化結果表明大部分細胞核呈黃染；將干細胞與牙胚細胞1∶1混合培養后，在熒光顯微鏡綠色熒光激發下有胞核呈綠色熒光的細胞，這表明這些細胞是共培養體系中標記BrdU的DPSC、EMSC。共培養體系中胞核呈綠色熒光的DPSC、EMSC在顯微鏡下觀察到有部分細胞胞漿呈現紅色熒光，表明在共培養體系中，DPSC、EMSC表達牙本質特異性蛋白DSP抗原。在單獨培養的TGC中，DPSC、EMSC是不表達DSP的。免疫組化染色圖像分析結果也表明3 d后共培養組與TGC單獨培養組DSP表達有差異，7 d后差異顯著。

牙齒的發育是一個復雜而又連續的過程，已經發現約50多種基因參與牙胚發育過程中的上皮-間充質間的信號調控[2]。由于成牙的微環境十分復雜，涉

及到各種基質成分、礦物離子和生長因子等，因此誘導微環境的創造在組織工程中的作用日益受到重視。Young等[3]將豬磨牙牙胚分離為單細胞懸液后與支架復合，移植于無胸腺大鼠大網膜內，觀察到牙冠結構的形成。將六齡豬第三磨牙的釉質器和間充質酶解分離形成的單細胞懸液植入膠原海綿，也觀察到釉質和牙骨質樣物。這些研究說明牙發育的信息，如位置、形態等調控的信息可能是存儲在單個細胞中的，牙胚中的牙源性上皮細胞和間充質細胞可以在體外培養液中共同生長，通過細胞之間的相互作用并分泌信號分子，這種強大的誘導因素可以促進細胞游走，誘導牙齒不同組織細胞按發育要求進行重新組合并形成相應組織。提示TGC分泌的信號因子有可能成為牙齒組織工程良好的誘導微環境。Duailibi等[4]證實出生后4 d獲得的鼠磨牙牙蕾細胞對于組織工程的構建是最佳的。出生后4 d，自然形成的鼠磨牙處于帽狀期，開始呈現細胞的分化，分離后的細胞在體外可以持續培養6 d。因此本組選用出生后4 d的大鼠TGC作為成牙誘導的微環境。

同一類型或不同類型的細胞通過旁分泌可溶性細胞因子或直接接觸而相互作用，這種作用是維持正常組織器官及細胞功能和結構的重要調節因素。骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cells，BMSC）與血管內皮細胞或皮膚成纖維細胞直接接觸培養可以誘導其形態和表型發生變化[5]。學者[6]將DPSC與成釉

細胞共培養，能夠促進成釉細胞分化和釉基質沉積。BMSC與牙周膜來源的細胞共培養，BMSC獲得了牙

周膜細胞的特征性蛋白表達。細胞融合是目前關于干細胞是否具有橫向分化能力爭論的焦點。學者[7]認為BMSC在體內通過與心肌細胞融合而獲得心肌細胞特征性的標志，并非發生了橫向分化，但細胞融合的發生率約為0.000 2%～0.001 1%。本研究中DPSC、EMSC與TGC共培養，細胞表達DSP陽性的轉化率遠高于細胞融合的幾率，無法單純用融合來解釋。

在發育過程中，牙乳頭細胞通過上皮和間充質間的作用，可以分化為成牙本質細胞，但是釉質上皮細胞影響間充質細胞分化的機制不清楚，ALP是成牙本質細胞分化的標志，成牙本質細胞比牙源性的未分化的間充質細胞顯示更高的ALP活性。Shiba等[8]分離培養了兔切牙的牙源性上皮細胞和牙髓細

胞，它們的ALP活性很低。共培養后，牙髓細胞的ALP活性上調。本研究結果也表明在TGC的誘導下，共培養組細胞的ALP活性增高。其中3、7 d組EMSC共培養組的ALP活性要高于DPSC共培養組，提示在體外成牙環境的誘導下EMSC分化能力要高于DPSC。

體外培養的TGC可能仍存儲成牙的信息和誘導間充質細胞的分化信息，本研究嘗試性地將混合培養的TGC作為誘導細胞分化的微環境，觀察到TGC與牙源性的間充質細胞DPSC、EMSC共培養后，能誘導細胞分化，表達成牙本質細胞的特異性蛋白DSP，成牙本質細胞分化的標志ALP的活性也增高。但由于時間所限，未對不同時期和不同的培養方法進行進一步探討，如能篩選出體外培養的最佳誘導微環境，將為組織工程化牙齒的構建提供新的思路。

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（本文編輯 杜冰）