復合氰基丙烯酸酯—骨形態(tài)發(fā)生蛋白生物膠預防大鼠牙槽嵴萎縮的實驗研究

[摘要] 目的 制備復合氰基丙烯酸酯-骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）生物膠，并植入大鼠拔牙窩觀察其預防牙槽嵴萎縮的效果。方法 選用Wistar大鼠54只，隨機分為3組：實驗組（復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠組）、對照組（殼聚糖溫敏性膠體組）、空白對照組。拔除大鼠下頜切牙后，實驗組和對照組在牙槽窩內(nèi)即刻植入復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠、單純殼聚糖溫敏性膠體，空白對照組則不植入任何材料。3組動物在植入后3、6、9周處死，分離切取下頜骨，用高頻鉬靶掃描儀獲得圖像信息，使用Image-Pro Plus軟件處理圖像，得到剩余牙槽嵴相對高度和牙槽窩相對光密度，組織學觀察牙槽窩內(nèi)的成骨情況。結(jié)果 術(shù)后3、6、9周，實驗組的剩余牙槽嵴相對高度和牙槽窩相對光密度均高于對照組和空白對照組（P<0.05）；組織學觀察顯示實驗組牙槽窩成骨多于對照組和空白對照組。

結(jié)論 復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠可以用于預防拔牙術(shù)后剩余牙槽嵴萎縮，其臨床應用前景廣闊。

[關(guān)鍵詞] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白； 氰基丙烯酸酯； 殼聚糖； 牙槽嵴萎縮

[中圖分類號] R 318.08 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.006

牙齒拔除后牙槽嵴呈失用性、進行性萎縮，給以后的種植體植入和常規(guī)義齒（尤其是全口義齒）修復帶來了極大的困難。42%的全口義齒修復不良都是牙槽嵴萎縮導致的義齒固位不好和咀嚼功能欠佳[1]。預防牙拔除術(shù)后牙槽嵴萎縮的研究一直是國內(nèi)外研究的熱門課題[2-3]。本研究以氰基丙烯酸正丁酯、殼聚糖為載體，加入重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（recombi-nant human bone morphogenetic protein，rhBMP）制備成生物膠體復合氰基丙烯酸酯-骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）生物膠，在大鼠牙拔除術(shù)后即刻植入牙槽窩內(nèi)，利用復合物的溫敏性效應和氰基丙烯酸正丁酯的聚合作用，達到固化、止血、消炎、誘導牙槽窩新骨形成的目的，從而預防牙槽嵴的萎縮[4-7]，為今后復合膠體在臨床的應用

提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 54只6～8周齡清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～200 g，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供。分籠飼養(yǎng)（5～6只/籠），飼養(yǎng)溫度（22±2） ℃，每日光照12 h，自由飲水，靜養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑及儀器 rhBMP（BBI公司，加拿大），β-

甘油磷酸鈉（Sigma公司，美國），氰基丙烯酸正丁酯（北京瞬康科技發(fā)展有限公司），殼聚糖（青島海匯生

物有限公司），磁力攪拌機（上海大中分析儀器廠），水浴箱（鞏義市予華儀器有限責任公司），高頻鉬靶掃描儀（Planmed Sophie公司，芬蘭）。

1.2 復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠及殼聚糖溫敏

性膠體的制備

復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠的制備[4，8]：將殼

聚糖溶解于濃度為16 mol·L-1的乙酸溶液中，在磁力攪拌器下按1∶1的比例逐滴加入到1.30 mol·L-1 β-甘油磷酸鈉溶液中，再持續(xù)攪拌0.5 h，制備成溫敏性膠體。在此基礎(chǔ)上使用95%鹽酸溶液將已經(jīng)準備好的溫敏性膠體調(diào)至pH值3.5，邊攪拌邊滴加適量氰基丙烯酸正丁酯，所得溶液中加入rhBMP使終溶液中rhBMP為100 μg·L-1，磁力攪拌器常溫下持續(xù)攪拌

3 h，密封后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ苽湮镒罱K狀態(tài)為白色膠體，半流動。

殼聚糖溫敏性膠體的制備：方法同復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠，止于溫敏性膠體的制備，不放入rhBMP及氰基丙烯酸正丁酯。

1.3 動物分組及手術(shù)

54只Wistar大鼠隨機分為3組：實驗組（復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠組）、對照組（殼聚糖溫敏性膠

體組）、空白對照組，每組18只，雌雄各半。

在吳哲等[9]建立大鼠剩余牙槽嵴吸收模型的基

礎(chǔ)上加以改進，分別于拔牙前12、9、6 d，麻醉大鼠（10%水合氯醛，腹腔注射，300 mg·kg-1），使用

持針器齊牙齦處夾斷左側(cè)中切牙牙冠造成冠折，用探針或細針向牙髓方向伸入，使牙髓損壞加劇。拔除牙齒時，自制探針分離牙齦，用持針器沿近遠中方向夾持，順牙冠根方向完整脫位。牙拔除后，即刻將氰基丙烯酸正丁酯-BMP生物復合膠、殼聚糖溫敏性膠體，使用注射器（針頭呈一定曲度彎曲，與牙

長軸平行）分別送入實驗組和對照組的牙槽窩。空

白對照組不放入任何材料，牙槽窩血液自行填滿，凝固。術(shù)后5 d，每日腹腔注射慶大霉素（10萬U/只）預防感染。

1.4 標本分離并檢測

各組大鼠分別于術(shù)后3、6、9周使用中性甲醛行心臟灌注處死，每次6只。將左右下頜骨完整分離，分離標本置于中性甲醛固定24 h。

1.4.1 牙槽嵴高度和牙槽窩光密度測定 將固定后的標本用高頻鉬靶掃描儀攝取軟X線片[10]，投照條件為電流30 mA，電壓20 kV，曝光時間0.4 s，標本舌側(cè)朝上放置，保持頰側(cè)牙槽嵴頂與膠片平行。

使用Image-Pro Plus軟件測定分析剩余牙槽嵴高度和牙槽窩光密度。1）剩余牙槽嵴高度：分別測定各個動物拔牙側(cè)和非拔牙側(cè)下頜第一磨牙牙槽骨最高點到舌側(cè)下牙槽突最前上點之間的距離，計算二者比值，得出剩余牙槽嵴相對高度（圖1）。2）牙槽窩

光密度：分析軟X線片，分別測定各個動物拔牙側(cè)牙槽窩光密度與未拔牙側(cè)牙槽窩光密度，計算二者比值，得出牙槽窩相對光密度。

上：未拔牙側(cè)；下：拔牙側(cè)；ab：切牙牙槽嵴的高度；cd：拔牙側(cè)牙槽嵴的高度。

圖 1 拔牙側(cè)與非拔牙側(cè)剩余牙槽嵴高度

Fig 1 The length of residual alveolar ridge of extracted side and

non-extracted side

1.4.2 組織學觀察 中性甲醛固定離體下頜骨24 h，硝酸（4%甲醛、8%硝酸、0.1%尿素）脫鈣，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋。4 μm切片，蘇木素-伊紅染色，倒置顯微鏡下觀察牙槽窩內(nèi)的成骨情況。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對計量資料進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

牙拔除術(shù)后即刻放入材料，可見對照組出血少，膠體凝固較快，實驗組次之，而空白對照組出血時間較長，需要待血凝塊形成。

所有傷口均為Ⅰ期愈合，無1例感染或排異反應。

術(shù)后3周可見3組標本無明顯差異，但空白對照組有肉芽組織增生；術(shù)后6、9周3組標本可以看到明顯的差別，空白對照組骨吸收最明顯，其次為對照組，實驗組骨吸收最少。實驗組和對照組中均可見到殘余的材料。

2.2 軟X線片觀察

軟X線片可見：術(shù)后空白對照組牙槽嵴頂水平吸收，形態(tài)較差，牙槽嵴高度明顯降低；實驗組的牙槽嵴吸收較少，牙槽嵴形態(tài)好，牙槽窩內(nèi)X線密度較高，高度降低不明顯；對照組介于二者之間（圖2）。

2.3 剩余牙槽嵴的相對高度

3組術(shù)后剩余牙槽嵴的相對高度見表1。從表1可見：術(shù)后3周，實驗組及對照組剩余牙槽嵴相對高度高于空白對照組，實驗組高于對照組（P<0.05）；第

6周，實驗組及對照組牙槽嵴相對高度明顯高于空白對照組，實驗組與對照組的差別也較明顯（P<0.05）；第9周，3組差異性更加明顯，與對照組及空白對照組相比，實驗組牙槽嵴相對高度明顯較大，吸收明顯減少（P<0.05），對照組與空白對照組間的差異較

小，但具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 牙槽窩相對光密度

3組術(shù)后牙槽窩的相對光密度見表2。從表2可見：術(shù)后3、6周，實驗組的相對光密度值略高于對照組及空白對照組（P<0.05），對照組略高于空白對

照組（P<0.05）；術(shù)后9周，實驗組相對光密度明顯高于對照組及空白對照組（P<0.05）。

2.5 牙槽窩內(nèi)成骨的組織學觀察

3組術(shù)后牙槽窩內(nèi)成骨的組織學觀察見圖3。術(shù)后3周，空白對照組可見少量毛細血管長入，但仍可見明顯的出血及炎性細胞，成骨少見，纖維生長明

顯；對照組及實驗組可見毛細血管較多，有少量骨組織生成，實驗組炎性細胞最少，骨組織最多（圖3）。術(shù)后6周，實驗組骨組織新生明顯，對照組骨組織較少，存在纖維組織，空白對照組纖維組織較多；術(shù)后9周，差異性更加明顯，實驗組及對照組有大量的新生骨組織，空白對照組新生骨組織最少。

3 討論

牙槽骨作為牙齒的支持組織，與牙齒有著密切的關(guān)系。牙齒的缺失會引起牙槽骨呈不可逆、持續(xù)性的吸收萎縮，而牙槽骨萎縮又可以間接影響相鄰牙齒的健康，從而牙槽骨萎縮呈進行性加劇。牙槽骨萎縮不可避免地使原有牙槽嵴高度及寬度喪失，這給今后常規(guī)義齒的修復以及種植牙的植入帶來困難，嚴重著無法進行義齒的修復。預防牙槽嵴高度的缺失仍然是今后研究的重點之一。

根據(jù)Block等[3]的分類將牙槽嵴的增高分為相對

增高法和絕對增高法，這兩種方法都需通過手術(shù)得以實施。前者是改變周圍解剖結(jié)構(gòu)，相對地增高牙槽嵴高度。后者很大程度上依賴所需材料的性質(zhì)，通常植入材料有異種骨、異體骨、自體骨、人工骨材料及組織工程骨等，但自體骨會給患者帶來二次創(chuàng)傷，異體骨、異種骨存在嚴重的免疫排斥反應，人工骨材料則價格較昂貴，組織工程骨不夠成熟，仍處在初期研究階段。這就需要一種材料來作人工骨材料和組織工程骨之間的過渡，即復合型的骨誘導材料[2，11]。

BMP具有較強的誘導成骨作用，其中rhBMP-2成骨作用最強[12]。在以往的研究中，往往骨形態(tài)發(fā)

生蛋白在骨缺損部位初始時達到了所需要的濃度，但后期由于吸收的速率比較快及受到炎性反應的影響，其作用受到了限制[13-15]。殼聚糖[16]為天然多糖，在臨床上是一種較好的載體材料，具有無免疫原性、無刺激性、無毒性、無致突變、無熱原反應及致死性突變效應等特性，多用于緩釋、抑菌、止血、抗腫瘤等[17]方面，但作為支架材料單獨使用存在降解快、承重不佳等缺點。α-氰基丙烯酸酯系早在1955年就被合成[18]，以后作為軟組織醫(yī)用膠在臨床上沿用至

今。但其作為載體的應用，也就是在納米技術(shù)興起之后，多用于制備載藥納米微粒[19]。然而氰基丙烯

酸酯單體在陰離子存在的情況下，微量水、醇或者弱堿的作用均會迅速激發(fā)單體陰離子的聚合，聚合

后的物質(zhì)具有性質(zhì)穩(wěn)定和更強的局部止血功能，并且凝固后還有一定的強度并能適應牙槽窩的形狀。本實驗應用的就是該體系中的α-氰基丙烯酸正丁酯。

本研究在殼聚糖溫敏性膠體的基礎(chǔ)上加入了rhBMP-2、α-氰基丙烯酸正丁酯制成復合生物制劑，制備的材料初始呈液體狀，有一定的黏性，流動性較佳，在遇到周圍溫度變化時可以出現(xiàn)凝固的狀態(tài)，利用這種性質(zhì)，將藥物低溫儲存于注射器中，使用時將其注射入牙槽窩，待其改變性狀發(fā)揮作用，使用方便快捷。利用α-氰基丙烯酸正丁酯呈微球、遇羥基可以聚合以及在人體溫度下膠體能夠聚合的特點，在牙拔除術(shù)后植入牙槽窩以起到止血、誘導骨形成、承重、提供足夠骨生長空間等作用。從本實驗可以看出，術(shù)后3周是牙槽骨高度喪失的高峰時期，此后牙槽骨喪失漸漸趨于穩(wěn)定，9周時達到穩(wěn)定期。術(shù)后3、6、9周，實驗組、對照組的牙槽嵴相對高度和牙槽窩光密度均大于空白對照組（P<0.05）。由于

殼聚糖也具有成骨作用，所以在不同時期對照組牙槽嵴相對高度和牙槽窩光密度也高于空白對照組。組織學觀察表明：術(shù)后3周時空白對照組大鼠牙槽窩內(nèi)可以看到明顯的出血及炎性細胞浸潤，實驗組炎性細胞最少，骨組織最多。這可能是由于氰基丙烯酸酯遇羥基后發(fā)生聚合，作為一種空間占用物阻礙并減少了炎性細胞的擴散，在緩慢的骨生長過程中，聚合后的物質(zhì)存在一定的孔隙，在其降解過程中，成骨細胞也伴隨爬行長入，最終骨組織代替聚合物，新骨生成，但在病理切片中未能看到實驗材料的存在，可能是由于材料性狀所決定，在制片過程中破壞脫落，僅見少量小裂隙。術(shù)后6周，實驗組骨組織新生明顯，對照組骨組織較少，存在纖維組織，空白對照組纖維組織較多；術(shù)后9周，差異性更加明顯，實驗組及對照組有大量的新生骨組織，空白對照組新生骨組織最少，此時牙槽嵴的吸收也趨于穩(wěn)定。由此可見，復合氰基丙烯酸酯-BMP生物膠可加快牙槽窩的愈合及骨化，從而預防剩余牙槽骨的吸收，在今后的臨床應用中前景比較廣闊。BMP雖然有較強的骨誘導作用，但局部作用范圍內(nèi)所持續(xù)的時間以及作用時間內(nèi)能達到骨誘導能力所需的濃度，是值得繼續(xù)思考的。氰基丙烯酸酯的性質(zhì)決定了材料的儲存時間并不長及在室溫條件下放置時間不能過久等特點，這些都需要進一步的探討研究。

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（本文編輯 李彩）