局部應(yīng)用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)超比例隨意皮瓣成活率的影響

[摘要] 目的 研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）聯(lián)合應(yīng)用對(duì)超比例隨意皮瓣成活率的影響。方法 采用密度梯度離心法和貼壁篩選法分離、培養(yǎng)人MSC，鑒定其純度及生物學(xué)特性。40只Wistar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、VEGF組、MSC組、MSC+VEGF聯(lián)合應(yīng)用組，每只大鼠背部設(shè)計(jì)2 cm×5 cm帶蒂皮瓣，術(shù)后連續(xù)14 d觀察皮瓣愈合情況。術(shù)后第14天處死各組動(dòng)物，計(jì)算皮瓣成活百分率；切取距蒂部4 cm處皮瓣行組織學(xué)檢查，觀察遠(yuǎn)蒂端皮瓣的微血管數(shù)量。結(jié)果 1）經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和成脂、成骨誘導(dǎo)方法鑒定，本研究分離并培養(yǎng)的MSC具有多向分化潛能。2）經(jīng)臨床觀察，各組大鼠均未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。空白對(duì)照組、VEGF組、MSC組、MSC+VEGF組動(dòng)物的皮瓣成活百分率分別為55.4%±4.4%、70.7%±6.3%、65.1%±7.1%、93.4%±9.4%，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組皮瓣成活百分率均高于空白對(duì)照組（P<0.05），MSC+VEGF組成活百分率最高，高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3）組織學(xué)檢查可見(jiàn)：與其他3組相比，MSC+VEGF組的肉芽組織最為豐富，成纖維細(xì)胞多，新生毛細(xì)血管最多。結(jié)論 1）采用貼壁篩選法和密度梯度離心法結(jié)合的方法可以得到純化且具有多向分化潛能的MSC；2）人MSC具有無(wú)免疫

反應(yīng)性或免疫反應(yīng)性低的特點(diǎn)，跨物種應(yīng)用不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)；3）VEGF和MSC聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，可在短期內(nèi)重建缺血區(qū)域的血液循環(huán)，解決超比例皮瓣的遠(yuǎn)蒂端缺血問(wèn)題，提高皮瓣成活率和創(chuàng)面組織的修復(fù)質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 皮瓣

[中圖分類號(hào)] R 782.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.020

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth

factor，VEGF）是一種可被大多數(shù)細(xì)胞分泌的糖蛋白二聚體分子[1]，相對(duì)分子質(zhì)量為3.4×104～4.5×104，可通過(guò)生成細(xì)胞間隙而增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。VEGF也是主要的低氧誘導(dǎo)性血管生成因子[2]，可通過(guò)自分

泌和旁分泌作用，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性以促進(jìn)血管生成，進(jìn)而起到促進(jìn)組織愈合的作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone

marrow mesenchymal stem cell，MSC）是存在于骨髓中的具有多種分化潛能的干細(xì)胞，增殖迅速，并具有低免疫原性的特點(diǎn)，能在特定的條件下向所有起源于中胚層的細(xì)胞分化。本研究根據(jù)VEGF和人MSC的生物學(xué)特性，將二者聯(lián)合應(yīng)用，觀察二者對(duì)超比例隨意皮瓣成活率的影響。

1 材料和方法

1.1 MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定

無(wú)菌條件下取人骨髓血2～5 mL，與等量L-DMEM培養(yǎng)液混合，1 000 r·min-1離心8 min使細(xì)胞形成微團(tuán)。棄去上清及脂肪層，再用L-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以等體積比輕輕疊加在分離液Percoll（質(zhì)量濃度1.073 g·mL-1）的液面上，2 500 r·min-1離心30 min。離心后，抽取培養(yǎng)液與分離液液面之間的單個(gè)核細(xì)胞層，加入L-DMEM培養(yǎng)液沖洗，1 200 r·min-1離心8 min，再用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以每毫升3×106～4×106個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中，37 ℃、5%CO2全濕度條件下培養(yǎng)24～48 h，換液去除未貼壁的懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3～4 d換液1次。待原代培養(yǎng)細(xì)胞接近匯合（匯合度大于80%）時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入胰酶消化細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞體收縮間隙變大，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化，吸取細(xì)胞懸液離心洗滌，800 r·min-1離心

8 min，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1∶3比例擴(kuò)增培養(yǎng)，此為第1代細(xì)胞。以相同方法培養(yǎng)細(xì)胞并傳代，依次為第2、3代，直至第12代。分別取第3、4代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志。

取3代以上細(xì)胞行成脂、成骨誘導(dǎo)，鑒定培養(yǎng)的MSC的生物學(xué)特性。成脂誘導(dǎo)方法：將細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后換用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并加入地塞米松1 μmol·L-1、吲哚美辛200 μmol·L-1、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）

0.5 mmol·L-1、胰島素10 μg·mL-1，每3 d半量換液，共誘導(dǎo)2周；誘導(dǎo)后棄去培養(yǎng)液用PBS洗1遍，加入12%中性甲醛溶液固定5 min，加入油紅O染液染色30 min，60%甲醛脫色數(shù)秒。成骨誘導(dǎo)方法：將細(xì)胞以每毫升1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)70%匯合時(shí)，換條件培養(yǎng)液（含地塞米松10 mmol·L-1、維生素C 2×104 mmol·L-1、磷酸甘油鈉10 mmol·L-1）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以后每隔3 d更換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)28 d后將細(xì)胞固定；用蒸餾水洗蓋玻片，滴加1%硝酸銀溶液置于強(qiáng)光下作用15～60 min，蒸餾水洗3 min，2%硫

代硫酸鈉溶液處理2 min，流水沖洗5 min，常規(guī)封片。

1.2 VEGF溶液的配制

采用通過(guò)大腸桿菌培養(yǎng)的重組大鼠VEGF165

（Sigma公司，美國(guó)）配制VEGF溶液。VEGF165質(zhì)量濃度為1.0～5.0 ng·mL-1時(shí)，以人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的計(jì)量依賴性刺激為標(biāo)準(zhǔn)，用蒸餾水重新配制VEGF，使其質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 g·L-1。將溶液再稀釋到蒸餾水中，形成0.5 g·L-1的VEGF作用液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

取40只Wistar大鼠（吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠體重（200±20） g，雌雄不限，隨機(jī)

分成A、B、C、D共4組，每組10只。A組為空白對(duì)照組，B組為VEGF組，C組為MSC組，D組為MSC+VEGF組。

1.4 動(dòng)物模型的制備

以大鼠背部為術(shù)區(qū)，用脫毛劑（硫化鈉、無(wú)磷洗衣粉、馬鈴薯粉混合制成，質(zhì)量比為3∶1∶1）脫毛，常規(guī)消毒。麻醉后沿標(biāo)記的2 cm×5 cm矩形皮瓣切開(kāi)皮膚全層至肌筋膜上方，皮瓣縱軸與大鼠長(zhǎng)軸平行，左右對(duì)稱。將制備好的VEGF按照不同分組的設(shè)計(jì)需要分6個(gè)注射點(diǎn)局部注射于筋膜下，將MSC（第4、5代

細(xì)胞）培養(yǎng)物涂于筋膜上。

1.5 臨床觀察

術(shù)后每日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否出現(xiàn)腹瀉、弓背、翹毛、精神萎靡及皮膚潰瘍等移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）的表現(xiàn)；同時(shí)觀察皮瓣的顏色、厚度、彈性、滲出、毛發(fā)生長(zhǎng)情況和壞死范圍，以及皮瓣筋膜上血管生成情況和針刺皮瓣出血情況。

1.6 皮瓣成活百分率的測(cè)定

皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn)：皮瓣顏色發(fā)黑，質(zhì)地堅(jiān)硬，經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)發(fā)生壞死。皮瓣存活面積計(jì)算方法：術(shù)后14 d麻醉動(dòng)物，用龍膽紫描畫(huà)皮瓣的范圍及壞

死部位，以市售硫酸紙臨摹繪制，以不同顏色區(qū)分壞死與成活區(qū)域；用計(jì)數(shù)坐標(biāo)紙格子數(shù)的方法計(jì)算皮瓣成活面積并換算為成活百分率，即皮瓣成活面積占整個(gè)皮瓣的比例。

1.7 組織病理學(xué)檢查

術(shù)后14 d于皮瓣中軸線上距離蒂部4 cm處取皮瓣全層，常規(guī)脫水包埋、切片，蘇木精-伊紅（hemato-

xylin-eosin，HE）染色，于光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MSC的分離、培養(yǎng)、鑒定結(jié)果

培養(yǎng)24～48 h后，鏡下可見(jiàn)散在的貼壁細(xì)胞，呈紡錘形；培養(yǎng)7～10 d，細(xì)胞形成放射狀克隆。培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，這種細(xì)胞的形態(tài)相對(duì)單一，增長(zhǎng)速度和貼壁速度快，易被胰酶消化，傳10代以上其形態(tài)及生長(zhǎng)特性亦無(wú)明顯改變。培養(yǎng)16～30 d，培養(yǎng)板上細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%，呈疊瓦樣或漩渦狀排列（圖

1）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，培養(yǎng)的細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD34和CD45，人白細(xì)胞位點(diǎn)DR抗原（hu-man leukocyte antigen locus DR，HLA-DR）持續(xù)陰性，CD29和CD44，CD73、CD105、CD166持續(xù)為陽(yáng)性。成脂誘導(dǎo)結(jié)果：誘導(dǎo)2周后用油紅O染色，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色（圖2）。成骨誘

導(dǎo)結(jié)果：經(jīng)硝酸銀染色，誘導(dǎo)組細(xì)胞呈深黑色，結(jié)節(jié)處染色更加濃厚，為強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果，表明有大量的鈣鹽沉積（圖3）。

× 40

2.2 臨床大體觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠均未見(jiàn)腹瀉、弓背、翹毛、精神萎靡及皮膚潰瘍等GVHD表現(xiàn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)死亡及感染現(xiàn)象。術(shù)后第7天，皮瓣壞死區(qū)域穩(wěn)定，成活與壞死區(qū)界限基本清楚，遠(yuǎn)端均形成較硬的痂殼。成活皮膚質(zhì)地顏色與周圍完全一致，有毛發(fā)生長(zhǎng)。結(jié)痂面積（即壞死組織）按多少排序依次為A、C、B、D組。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組皮瓣結(jié)痂面積均小于空白對(duì)照組，MSC+VEGF組的結(jié)痂面積小于VEGF組和MSC組。術(shù)后第14天，皮瓣成活情況與術(shù)后第7天無(wú)明顯差異（圖4）。

2.3 皮瓣成活百分率

空白對(duì)照組、VEGF組、MSC組、MSC+VEGF組動(dòng)物的皮瓣成活百分率分別為55.4%±4.4%、70.7%±6.3%、65.1%±7.1%、93.4%±9.4%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的皮瓣成活百分率均高于空白對(duì)照組（P<

0.05），VEGF和MSC組間無(wú)明顯差異（P>0.05）；MSC+VEGF組成活百分率最高，高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

空白對(duì)照組可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死組織，細(xì)胞成分少見(jiàn)，新生血管較少；VEGF組肉芽組織較為豐富，細(xì)胞成分較多，有較多的新生血管；MSC組亦可見(jiàn)肉芽組織、細(xì)胞成分及新生血管，但均較VEGF組數(shù)量少；MSC+VEGF組肉芽組織最為豐富，成纖維細(xì)胞多且新生毛細(xì)血管最為豐富（圖5）。

3 討論

隨意皮瓣是臨床上常用的一種皮瓣，微小血管是這種皮瓣主要的血液供應(yīng)渠道，皮瓣內(nèi)部的血液循環(huán)是影響皮瓣成活的最主要因素，故超出一定的長(zhǎng)寬比例往往會(huì)出現(xiàn)皮瓣遠(yuǎn)蒂端的缺血缺氧或壞死。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生和毛細(xì)血管袢的形成，促進(jìn)活體血管的生成。MSC是一種具有多向分化潛能和自我復(fù)制功能的早期未分化細(xì)胞，在特定條件下可以分化成不同的功能細(xì)胞，形成多種組織和器官。

目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)均采用貼壁篩選法和密度梯度離心法相結(jié)合的方法分離純化MSC。MSC沒(méi)有特異性表面標(biāo)志物，其鑒定常采用聯(lián)合鑒定法。Frieden-stein等[3]采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，顯示原代培養(yǎng)細(xì)

胞的同源性可達(dá)到95%～98%，2代以后可達(dá)100%。本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果和成脂、成骨誘導(dǎo)結(jié)果證明采用貼壁篩選法和密度梯度離心法結(jié)合的方法分離培養(yǎng)的MSC純度較高，具有高分化潛能，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以發(fā)揮其生物學(xué)特性。

目前對(duì)于MSC的研究主要采用同種異體途徑。有學(xué)者[4-5]認(rèn)為：同種異體MSC移植的低免疫原性與MSC的純度密切相關(guān)，純化的MSC具有獨(dú)特的免疫原性。Mansilla等[6]通過(guò)實(shí)驗(yàn)性研究證實(shí)了人MSC沒(méi)

有免疫反應(yīng)性并且可以通過(guò)物種間防御屏障，注入低級(jí)脊椎動(dòng)物后不會(huì)引起血液動(dòng)力學(xué)紊亂。本實(shí)驗(yàn)選取第4、5代MSC用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，整個(gè)過(guò)程中大鼠均未出現(xiàn)腹瀉、弓背、翹毛、精神萎靡及皮膚潰瘍等GVHD表現(xiàn)，說(shuō)明所培養(yǎng)的MSC純度較高，也證明人MSC沒(méi)有免疫反應(yīng)性或者具有低免疫反應(yīng)性的特征，跨物種應(yīng)用不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞功能的發(fā)揮與其周圍局部微環(huán)境的相互作用密切相關(guān)，MSC的分化方向與微環(huán)境壁龕（niche）密切相關(guān)[7]，其分化方向由微環(huán)境所調(diào)控。Fang等[8]發(fā)現(xiàn)：移植的MSC具有向病變部位遷移并分化成機(jī)體所需的相應(yīng)細(xì)胞的能力。MSC可分化成為成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞[9]，前者是皮膚重

建的重要細(xì)胞，后者參與傷后1周內(nèi)的組織重建及組織重建過(guò)程中的血管形成。國(guó)內(nèi)外關(guān)于MSC和VEGF提高皮瓣成活率的報(bào)道很多，但是將二者聯(lián)合應(yīng)用

來(lái)探討其有效性的研究還較少。本研究將VEGF和MSC聯(lián)合應(yīng)用于超比例隨意皮瓣，并設(shè)空白對(duì)照組、單純MSC和VEGF組，通過(guò)臨床大體觀察和組織病理學(xué)方法觀察術(shù)后皮瓣遠(yuǎn)端的血管新生情況及血管密度，探討VEGF和MSC兩種物質(zhì)在分別應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用的情況下對(duì)促進(jìn)超比例皮瓣成活率的有效性。臨床大體觀察可見(jiàn)各組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未出現(xiàn)死亡及皮瓣感染的情況。空白對(duì)照組結(jié)痂最快、面積最大，MSC組較VEGF組結(jié)痂速度快，VEGF+MSC組結(jié)痂速度最慢、面積最小。術(shù)后第7天，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮瓣壞死區(qū)域穩(wěn)定，成活與壞死界限基本清楚，遠(yuǎn)端均形成較硬的痂殼。成活皮膚質(zhì)地顏色與周圍完全一致，有毛發(fā)生長(zhǎng)。4組動(dòng)物中，VEGF和MSC聯(lián)合應(yīng)用組的皮瓣成活率最高。組織學(xué)檢查可見(jiàn)MSC組真皮下毛細(xì)血管增多，肉芽組織及成纖維細(xì)胞增多，但均較VEGF組少；VEGF+MSC組皮瓣真皮下肉芽組織豐富、成纖維細(xì)胞增多、膠原纖維排列規(guī)整、新生毛細(xì)血管最多。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了VEGF和MSC均可促進(jìn)超比例隨意皮瓣遠(yuǎn)蒂端新生血管的形成，提高皮瓣成活率。VEGF與MSC的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)微血管新生的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于二者單獨(dú)應(yīng)用的情況，二者在提高超比例隨意皮瓣成活率方面有協(xié)同作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Robinson CJ， Stringer SE. The splice variants of vascular endothe-

lial growth factor（VEGF） and their receptors[J]. J Cell Sci， 2001，

114（5）：853-865.

[2] Schultze-Mosgau S， Wehrhan F， R?del F， et al. Improved free vas-

cular graft survival in an irradiated surgical site following topical

application of rVEGF[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2003， 57

（3）：803-812.

[3] Friedenstein AJ， Gorskaja JF， Kulagina NN. Fibroblast precursors

in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J]. Exp He-

matol， 1976， 4（5）：267-274.

[4] Saito T， Kuang JQ， Bittira B， et al. Xenotransplant cardiac chi-

mera： Immune tolerance of adult stem cells[J]. Ann Thorac Surg，

2002， 74（1）：19-24.

[5] Bos C， Delmas Y， Desmoulière A， et al. In vivo MR imaging of

intravascularly injected magnetically labeled mesenchymal stem

cells in rat kidney and liver[J]. Radiology， 2004， 233（3）：781-789.

[6] Mansilla E， Marin GH， Sturla F， et al. Human mesenchymal stem

cells are tolerized by mice and improve skin and spinal cord in-

juries[J]. Transplant Proc， 2005， 37（1）：292-294.

[7] Spradling A， Drummond-Barbosa D， Kai T. Stem cells find their

niche[J]. Nature， 2001， 414（6859）：98-104.

[8] Fang LJ， Fu XB， Sun TZ， et al. Preliminary observation on diffe-

rentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into epidermal

cells in pig[J]. Chin J Traumatol， 2003， 6（4）：212-214.

[9] 趙春華， 廖聯(lián)明. 對(duì)成體干細(xì)胞可塑性的新認(rèn)識(shí)及其在再生醫(yī)

學(xué)中的意義[J]. 中華血液學(xué)雜志， 2003， 24（2）：57-58.

Zhao Chunhua， Liao Lianming. New understanding about plasticity

of adult stem cells and its implications in the regenerative medi-

cine[J]. Chin J Hematol， 2003， 24（2）：57-58.

（本文編輯 吳愛(ài)華）