過敏原分離純化技術的研究進展

孫秀蘭，單曉紅，張銀志，管 露，尹德成

（1.江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

過敏原分離純化技術的研究進展

孫秀蘭1，2，單曉紅2，張銀志1，管 露2，尹德成2

（1.江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

過敏原是引起過敏反應的抗原性物質，對它的檢測是預防發生過敏反應的重要方法，而過敏原分離純化是過敏原檢測技術的基礎。主要敘述了過敏原的致敏機理，同時詳細敘述了沉淀法、疏水性相互作用色譜、離子交換色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、膜分離、蛋白質組學和人工合成過敏原技術在過敏原分離純化中的研究進展，重點介紹蛋白質組學和人工合成過敏原技術這兩種分離純化的新方法。

過敏原，純化，表征

過敏反應在日常生活中很常見，是在全世界廣泛流行的由過敏原引起的一類變態反應性疾病。引起人體過敏反應的物質有很多，但大體主要分為兩類，一是環境，環境中能刺激機體發生過敏反應的物質都可以叫過敏原，比如室內灰塵、花粉類、真菌類、獸毛和纖維等[1]；二是食物，食物中也有許多能引起人的過敏癥狀。已有160多種食物被確認具有過敏原性。FAO報告的8類過敏食物為主要的食物過敏原來源，約占所有食物過敏原的90%，廣泛分布于農作物、畜禽產品和水產品中，它們是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類（蝦、蟹、龍蝦）、花生、大豆、核果類（杏子、腰果等）及小麥[2]。由于食物分布的廣泛性，再加上現在人們物質生活的豐富，發生過敏反應的機會也越來越多，而過敏反應能引起急性或慢性疾病，已經嚴重影響了部分人群的生活質量和生命安全，因此對食物過敏原的檢測是十分必要的，而高純度且具有免疫活性的過敏原是檢測技術的物質基礎，因此過敏原分離純化是過敏原研究發展中至關重要的一環。

1 過敏原致敏機理

過敏原是指能選擇性地激活T細胞和B細胞，誘導產生特異性IgE抗體，引起變態反應的抗原性物質。一般來說，動物性食物過敏反應很少見，大多只發生在雞蛋和牛奶中，而植物性食物種類就很多。這主要是因為植物受到外來的刺激損傷或襲擊時，它們就會產生一系列應激反應并合成蛋白質來保護自己[3]。一般稱合成的蛋白為防御蛋白或致敏蛋白。致敏蛋白具有對T細胞和B細胞的識別區，能夠產生特異性的抗體，因此過敏原就含有T細胞抗原決定簇和B細胞抗原決定簇。抗原決定簇是過敏原中參與抗體結合的組成部分，是引發食物過敏反應的免疫學物質基礎，它一般是小于16個氨基酸殘基的短肽，現在了解得比較清楚的是牛奶中的過敏原。Véronique Schulten等采用了32個重疊肽分析T細胞識別表位，從而確定了αs1-酪蛋白肽鏈17～36位，69～78位，109～120位和173～194位可被IgE識別，其中69～78位和173～194位只被終身過敏的人群所識別[4]。Gloria García-Casado等研究發現аs2-酪蛋白有4個抗人血清B細胞識別的主要表位（IgE表位），分別為肽鏈83～100位，143～158位，157～172位，165～188位；其中83～100位和165～188位為最主要過敏原，143～158位含有一個磷酸化的位點，這可以增加其過敏性；αs2-酪蛋白的6個次要IgE表位分別為：肽鏈31～44位，43～56位，93～106位，105～114位，117～128位，191～200位[5]?？乖缘拇笮∫话闩c分子量有關，當分子量在一萬以上的時候，就會產生免疫刺激，從而引發特異性IgE抗體，隨后與肥大細胞或嗜堿粒細胞表面結合，如果機體第一次接觸該抗原，機體會成為致敏狀態。當再次接觸該抗原后，就會發生過敏反應。該反應的機理是：抗原與肥大細胞或嗜堿粒細胞表面上的IgE抗體結合，在鈣離子的作用下，肥大細胞破潰和嗜堿粒細胞脫顆粒，釋放許多生物活性物質，如白三烯、組胺等，這些物質的釋放就會出現一些常見的過敏癥狀，如粘膜水腫、平滑肌痙攣、分泌亢進等，還有一些物質叫做半抗原，由于分子量太小，不能直接成為抗原，但與其他物質復合后就可以成為抗原。

2 過敏原分離純化技術

2.1 分離純化天然過敏原

2.1.1 鹽析沉淀法 水溶液中的蛋白質溶解度一般在生理離子強度范圍內最大，而低于或高于此范圍時溶解度均降低。一般認為，向蛋白質的水溶液中逐漸加入電解質時，開始階段蛋白質的溶解度增大，這種現象稱為鹽溶，隨著電解質強度的增大，蛋白質在高離子強度的溶液中溶解度降低、發生沉淀的現象稱為鹽析。在食品過敏原的分離純化過程中，常用硫酸銨來粗分這些過敏蛋白。

使用比較多的是大豆、牛乳、雞蛋等食品中的過敏原提取[6-8]，目前，這種方法一般不會單獨使用，而是作為一個預處理的步驟來粗提純過敏原，之后還要與其他方法結合進一步提純，如離子交換、親和層析、凝膠過濾等。

2.1.2 等電點沉淀法 等電點沉淀法是利用蛋白質在pH等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀分級的方法。這種方法適用于疏水性較大的蛋白質，如酪蛋白。因此，這種方法在牛乳過敏原的分離純化中使用得較多，其他的食物提取中一般不使用這種方法，而且，這種方法也很少單獨使用，經常是與鹽析法結合在一起使用。

蔣紅玲等[9]采用等電點沉淀法分離出脫脂乳中酪蛋白，（NH4）2SO4兩步法鹽析乳清，去除大量雜蛋白后，經純化，得到酪蛋白、β-Lg和α-La這三種牛奶中的過敏原組分，并且取得了較好的分離純化效果，純度都大于90%。這種方法經濟便捷、重復性好，是牛奶中蛋白提取比較常見的粗提方法。

2.1.3 疏水性相互作用色譜（HIC） HIC是利用表面偶聯弱疏水性基團的疏水性吸附劑為固定相，根據蛋白質與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質類大分子分離純化的洗脫色譜法。HIC是基于疏水性吸附分離純化蛋白質類生物大分子，與離子交換色譜互補短長，可以分離純化離子交換層析難以分離的蛋白質，而且它可以調節疏水配基鏈長和密度調節吸附力，可以根據目標產物的性質選擇適宜的吸附劑，因此在過敏原的分離純化過程中，可以使蛋白質的損失減到最小。該技術已成功被用于過敏原的分離純化。

Roland Suck等人[10]直接使用疏水作用層析將貓尾草主要過敏原Phlp1和Phlp 2/3分離純化出。P.Cadot等人[11]則是通過疏水作用層析和離子交換聯合使用，純化了18ku的花粉過敏原Bet v 7，得到的純度為94%。

2.1.4 離子交換色譜（IEC） 離子交換色譜利用離子交換劑為固定相，是根據荷電溶質和離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質分離的洗脫色譜法。它是蛋白質、肽和核酸等生物產物的主要分離純化手段，它的應用范圍廣泛，處理料液量大，分離過程具有濃縮作用，而且產品回收率高。

楊睿等[12]利用層析對大黃魚過敏原進行純化，使得大黃魚粗提液蛋白中過敏原的含量從50%左右上升到90%，并且均具有免疫活性。吳序櫟等人[13]通過離子交換層析初步分離出了21、11ku的過敏原蛋白，而且含量較高且具有免疫活性。張英坤等人[38]使用離子交換層析法分離花生過敏原Ara h 2時，純度達到了90%，得率為21.9%，該方法為過敏原的分離研究提供了可行的實驗參數。Janine E.Beale等人[40]在純化魚小白蛋白時，先使用硫酸銨進行粗提，再利用陰離子交換柱進行純化，得到純度較高的三種小白蛋白過敏原。Satoshi Koyanagi等人[41]在研究規?；a塵螨過敏原C8/119S時，使用兩次離子交換和一次疏水層析色譜進行純化得到的重組過敏原，純度達到99%，從而可以高效地生產過敏原。

2.1.5 凝膠過濾色譜（GFC） GFC是利用凝膠粒子（通常稱為凝膠過濾介質）為固定相，根據料液中溶質相對分子質量的差別進行分離的液相色譜法。溶質由于分子大小的不同而被分離，在洗脫的過程中，相對分子質量大的溶質由于不能進入凝膠孔，所以最先被洗脫下來，而相對分子質量小的溶質進入凝膠孔，流速緩慢，洗脫下來的時間較長，因此出峰時間較后。它通常是用于蛋白質等生物大分子的分級分離和除鹽。與其他色譜法相比，GFC的最大特點是操作簡便，可采取恒定洗脫法洗脫展開，而且速度快、精度高、蛋白活性收率高。但由于該技術僅基于溶質之間的相對分子量的差別，選擇性低，一般需和其他操作聯合進行，如超濾、離子交換和親和色譜等。

Hiroyuki Tanaka等人[14]用DE52纖維素和瓊脂糖凝膠以及高效液相色譜純化分離大麻花粉過敏原，從而分離并且純化出大麻花粉的五種過敏原。M.Luisa Tejera等人[15]在對橄欖樹的一種新的過敏原Olee 7進行分離純化時，將凝膠過濾層析和反相高效液相色譜聯合使用，將原先未發現的過敏原分離純化出來，并且得到的純度較高，為分子表征的分析提供了基礎。

2.1.6 親和層析 生物分子能夠區分結構和性質非常詳盡的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結合，利用生物分子間的這種特異性結合作用的原理進行生物物質分離純化的技術稱為親和分離。親和層析具有高度的選擇性，在過敏原純化的應用中是比較常見的。

Fariba Karamloo等人[16]在研究樺樹花粉過敏原時，對從大腸桿菌中提取出來的過敏蛋白進行純化時，使用了Ni螯合親和層析，純化后的純度達到了90%。Lai-Chen Tsai等人[17]在分離純化一種新型的98ku的塵螨過敏原時，使用親和層析，使得蛋白的純化回收率高達80%，并且純化后的過敏蛋白具有生化和免疫特點。

2.1.7 膜分離 膜分離法包含非常豐富的內容，但在生物分離領域應用得比較多的是超濾、透析等，其中超濾在過敏原的分離過程中起著非常重要的作用。超濾是根據高分子溶質之間或高分子與小分子溶質之間相對分子質量的差別進行分離的方法，它是利用膜的篩分性質，以壓差為傳質推動力，將原料液中溶劑及小溶質粒子從高壓的料液側被膜透過到低壓側，而相對分子質量相對較高的蛋白組分被膜所截留，其他小的溶質顆粒和水則能透過膜，從而達到選擇性分離的目的。透析是利用具有一定孔徑大小、高分子溶質不能透過的親水膜將含有高分子溶質和其他小分子溶質的溶液與純水或緩沖液分隔，由于膜兩側的溶質濃度不同，在濃差的作用下，高分子溶液中的小分子溶質透過膜向另一側，而另一側的水則透向高分子溶液中。這兩種方法和設備都很簡單，價格低廉，在過敏原的分離過程中，超濾使用得最多，而且通常與其他技術聯用。

Barbara Pantera等人[18]從黃蜂毒液中純化得到主要過敏原Polistes gallicus時，使用了超濾和親和層析柱，純化出四種過敏原，并且純度很高，為他們對這些過敏原的表征奠定了基礎。Plaimein Amnuaycheewa等人對大豆制品中的過敏原（Gly m 3）進行純化表征時，將透析、超濾和親和層析聯合使用，從而得到的過敏原的純度在豆奶中為（4.37±0.14）～（7.24±0.30）mg/g蛋白質之間，而其他發酵豆制品中Gly m 3的含量為（1.67±0.02）～（5.47±0.02）mg/g蛋白質之間，純化的效率很高。

2.1.8 蛋白質組學 蛋白質組學（proteomics）是指研究蛋白質組的技術及這些研究得到的結果。李林[37]在2000年就對蛋白質組學的研究前景以及發展方向做了預測，他認為質譜法和同位素標記法的聯合使用可以定量分析蛋白質表達水平的差異，雙向電泳技術和質譜技術是蛋白質組學的關鍵技術。從現在的研究成果看，他的分析大部分都是正確的。在現代的蛋白質組學研究中，二維電泳和質譜技術的黃金組合是科學家掌握蛋白質表達規律的基礎。二維電泳主要是用來分離蛋白質，可以將不同種類的蛋白質按照等電點和分子量的差異進行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000～3000種蛋白質進行分離。電泳后對膠進行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質表達的異同，可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質樣品，然后在同樣條件下進行二維電泳，染色后比較兩塊膠；也可以將二者的蛋白質樣品分別用不同的熒光染料標記，然后兩種蛋白質樣品在一塊膠上進行二維電泳的分離，最后通過熒光掃描技術分析結果。膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統成像，然后通過分析軟件對蛋白質點進行定量分析，并且對感興趣的蛋白質點進行定位。通過特定的蛋白質點切割系統，可以將蛋白質點所在的膠區域進行精確切割。接著對膠中蛋白質進行酶切消化，酶切后的消化物經脫鹽/濃縮處理后就可以通過點樣系統將蛋白質點樣到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后這些蛋白質就可以在質譜系統中進行分析，從而得到蛋白質的定性數據，這些數據可以用于構建數據庫或和已有的數據庫進行比較分析。蛋白質組學注重研究參與特定生理或病理狀態的所有蛋白質種類及其與周圍環境（分子）的關系。因此蛋白質組學的研究通常是通量高而速度快，配合相應分析軟件和數據庫，研究者可以在最短的時間內處理最多的數據。A.I. Sancho等人[20]對于蛋白質組學在過敏原分離上的應用進行了闡述，并且提出了蛋白質組學在過敏原分離上的可行性，以及對過敏原分析進行標準化這一概念，這對我們分離蛋白質以及之后的應用有很大的啟示，為蛋白質組學在過敏原分離純化上的應用奠定了基礎。

2.2 人工合成過敏原

人工合成過敏原的一般方法是通過查閱文獻結合生物信息學方法選取得到某種物質過敏原的主要抗原表位區，構建該區段及其二聚體的原核表達載體，得到具有免疫學活性的高表達抗原表位蛋白。具體過程是：首先選取過敏原蛋白中的一段，作為目標基因，這段基因具有確切的抗原表位。選定目標基因之后，就可以為這段目標基因設計引物，進行PCR擴增，從而可以得到抗原表位區基因和二聚體基因，然后構建重組質粒，轉化到宿主細胞，誘導使之產生過敏蛋白，這種過敏蛋白是以包涵體的形式出現的，隨后就可以收集蛋白并純化鑒定過敏原的免疫原性。Elena Tambobrini等人[21]就是通過這種方法，在大腸桿菌中得到合成的重組過敏原Lol pⅡ，并用凝膠電泳和聚丙烯酰胺電泳對其進行了純化和鑒定。這種重組過敏原的產量非常高，而且很容易純化，它和天然的過敏原對IgE的結合能力相當，并且免疫原性和天然蛋白相當，是一種很穩定的過敏原蛋白。Katrin Lehmann等人[22]同樣也是在大腸桿菌中得到了花生主要過敏原Ara h 2，這種過敏原也是高度表達并且免疫原性也同天然蛋白相當。Yukihiro Kobayashi等人[23-26]發現了異尖線蟲的主要過敏原Ani s 1，他們也是通過重組過敏原在大腸桿菌中表達的方法，來得到純的并且產量多的過敏蛋白，從而可以研究這種蛋白的功能，作為一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑。Budhi Pandjaitan等人[27]在研究重組狗白蛋白時，就是完全按照上述方法，重組載體轉化到大腸桿菌中，然后得到包涵體、蛋白等，再進行純化，得到高純度和高產量的重組過敏原蛋白。其他很多學者都使用這種方法來得到純的并且具有免疫活性的過敏蛋白。Motohik Suzuki等人[28]對日本柏樹主要過敏原Cha o 1進行分子克隆，對其進行純化，從而得到該過敏原。M.Serdal Sevinc等人[29]對青霉的主要過敏原Pen b 26使用這種方法進行了表達和純化，同樣得到了高收率以及具有免疫活性的過敏原蛋白。李輝嚴等人[39]在大腸桿菌中高效表達了重組粉塵螨過敏原并獲得了大量的純化蛋白，并且從實驗中發現這種重組過敏原具有低過敏原性，可應用于易于標準化的安全高效的脫敏治療劑。

人工合成過敏原的基礎就是必須清楚過敏原的表征。過敏原的表位即抗原表位，又稱抗原決定簇，是肽類抗原與抗體或受體接觸的部位，是抗原分子表面幾個氨基酸殘基組成的特殊序列及其空間結構，是抗原特異性的基礎，它由兩種要素組成，其一是氨基酸的順序，其二是氨基酸的空間構象。根據過敏原表位與細胞結合方式，可分為B細胞表位和T細胞表位；根據表位結構的不同，又可分為連續性過敏原表位（線性表位）和不連續性過敏原表位（構象性表位）。線性表位主要是識別過敏原中的特定的氨基酸序列，一般比較多見，而且易于定位；而構象性表位則不同，它是一些不連續的氨基酸通過分子內及分子間相互作用等使之相互接近，形成表位，這種構象性表位一般不穩定，隨著三級結構的破壞，其表位也會破壞，同時可能會產生新的表位。Thien Van Do等人[30]研究了阿拉斯加青鱈和普通鱈魚過敏原的表征，發現阿拉斯加青鱈過敏原的過敏性比普通鱈魚的過敏性高18%，而其他免疫原性都幾乎差不多。Claudia de Lalla等人[31]研究黑麥花粉過敏原Lo1 p II時，發現在過敏原抗原表位區的第39～51位氨基酸是與抗體直接結合的部位。Angel Vallverdu等人[32]在研究重組青蒿主要過敏原時，發現重組的過敏原具有與天然的過敏原相同的免疫活性，這是因為這種重組的過敏原具有β折疊。Tsunehiro Aki等人[33]比較了重組和天然塵螨的免疫學表征，發現這兩者的免疫原性很接近，重組過敏原與IgE的反應識別率達到了80.6%，而天然的過敏原（Der f 1和Der f 2）與IgE的識別率分別是90.3%和74.2%。Yago Pico de Coana等人[34]在研究柏木的新的過敏原Cup a 4時，發現這種新的過敏原含有四種過敏表位區域，與柏木其他的過敏原有相似性。Liselotte Kaiser等人[35]研究貓主要過敏原Fel d 1的結構表征，發現這種過敏原有兩個表征位點，一個是外部鈣離子結合位點，另一個是蛋白質內部鈣離子結合位點。

當然重組過敏原并不是都能成功的，Erica van Oort等人[36]發現重組過敏原group1很難正確的折疊，所以效果都不好，因此需用天然的過敏原來代替。他們找到的天然過敏原與重組過敏原的同源性達到了98%，因此很適合作為替代。

3 展望

過敏原的分離純化是研究其過敏原性的基礎，是對其進行開發利用的重要環節，目前關于過敏原的分離純化技術有很多，但是使用時還需注意以下幾點：一是考慮使用時的生產成本和經濟效益，選擇合適的方法是很重要的；二是同時使用幾種純化方法，使過敏原的純化效率提高；三是可以進行新技術的開發，使過敏原得到高效的純化。

新技術的使用對于過敏原的分離純化來說是一個突破口，如蛋白質組學和過敏原的表征這些方面，在過敏原方面的運用才剛剛起步，但是優勢已經顯現出來，如運用過敏原的表征，可以創造出重組過敏原，從而可以得到高產量和高純度的過敏原蛋白。但同時也需要注意，重組過敏原的免疫原性是否有變化，若是和天然的過敏原免疫原性差別較大，那么就有可能失去重組過敏原的意義，因此今后的工作就是怎樣得到準確折疊的重組過敏原。目前研究的主要是花生和雞蛋中的過敏原，由于運用一般的分離純化技術得到的過敏原純度不是很高，今后的工作重點在于純熟地運用蛋白質組學和重組過敏原這些新興的技術，從而獲得純度較高的過敏原，為過敏原的檢測奠定基礎。

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Research progress in allergen purification

SUN Xiu-lan1，2，SHAN Xiao-hong2，ZHANG Yin-zhi1，GUAN Lu2，YIN De-cheng2
（1.The State Key Lab of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Allergens antigenic substances that cause allergic reactions，its detection is an important method to prevent allergic reactions，and purification of allergens is the basis for allergen detection.This paper describes the mechanism of allergen sensitization，while detailed description of the precipitation，hydrophobic interaction chromatography，ion exchange chromatography，affinity chromatography，gel filtration chromatography，membrane separation，proteomics and synthetic allergen in purification of allergens in the research progress，focusing on synthetic technology of this new method of allergen.

allergen；purification；characterization

TS201.1

A

1002-0306（2012）05-0391-05

2011-04-20

孫秀蘭（1976-），女，博士，教授，主要從事食品安全檢測方面研究。

“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAK10B03）；973“國家重點基礎研究發展計劃資助”項目（2012CB720804）；2010年度公益性行業（農業）科研專項項目（201003008-08）。