梓葛凍干粉針劑對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外缺血再灌注模型損傷的保護作用

張聰聰 ，馬 強 ，薛 強 ，陳 剛 ，徐曉玉

（1.西南大學(xué)藥學(xué)院重慶市藥效評價工程技術(shù)研究中心，重慶400716；2.重慶工商大學(xué)藥物研究中心，重慶400067）

梓葛凍干粉針劑為本實驗室創(chuàng)制的治療腦缺血損傷的中藥復(fù)方新藥，主要由梓醇和葛根素組成。其處方思路基于腦缺血疾病的復(fù)雜性，針對多靶點、多途徑治療入手，選擇各有效成分進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，其處方與制備工藝已經(jīng)申報國家技術(shù)發(fā)明專利。課題組既往研究顯示，梓醇能夠促進(jìn)離體培養(yǎng)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長［1］，促進(jìn)腦缺血大鼠缺血周圍區(qū)皮質(zhì)血管新生，同時改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹［2-3］，并能顯著改善局灶性永久性腦缺血大鼠神經(jīng)功能［4］。葛根素具有神經(jīng)保護作用［5］，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，改善神經(jīng)行為活動［6］。上述結(jié)果提示，將中藥單體梓醇和葛根素組方可能成為治療腦血管疾病的候選藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，器官缺氧-復(fù)氧損傷時血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所起的主要作用和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人體生理的相似性和可獲得性，本研究采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以缺氧-復(fù)氧的方式模擬整體水平的缺血再灌注損傷，觀察中藥單體組方梓葛凍干粉針劑對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型損傷的保護作用，為其用于腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 梓葛凍干粉針劑由西南大學(xué)中藥研究所研制提供，主要成分為梓醇和葛根素，批號：20100512；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Hyclone血清購自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號：NVM0347；Bcl-2、Bax，Caspase-3，GAPDH，β-actin 抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑和PVDF膜購自 Millipore公司；一氧化氮（NO）測試盒，批號：20100902，丙二醛（MDA）試劑盒，批號：20100728，超氧物歧化酶（SOD）試劑盒，批號：20100728，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，批號：20100312，均購自南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶（Trypsin），四氮唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司。尼莫地平購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：J20100002；其余試劑如二甲基亞砜（DMSO）、鹽酸等均為進(jìn)口分裝或市售分析純。

1.1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國NACPO6000）；電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；紫外分光光度計（日立高新 U-3010）；純水系統(tǒng)（Millipore）；高速冷凍離心機（Eppendorf 5417R）；超低溫冰箱（Thermo）；倒置顯微鏡（德國 Ziss IX71），酶標(biāo)儀（美國 BioTek Elx800），缺氧裝置乃本實驗室自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外缺血再灌注模型的建立 模型以1997年Danica Stanimirovic D等［7］報告的方法加以改進(jìn)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）常規(guī)培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，用D-Hanks液沖洗2次，將所有孔換成無血清缺氧培養(yǎng)液（Krebs液），放入經(jīng)95%N2、5%CO2的混合氣飽和的密閉自制缺氧容器中，37℃培養(yǎng)4 h，然后取出培養(yǎng)板，將缺氧培養(yǎng)液換成25 mL/L胎牛血清DMEM后于37℃、5%CO2條件下復(fù)氧培養(yǎng)2 h。

1.2.2 分組及給藥 正常組：細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；模型組：細(xì)胞在給予上述缺氧處理4 h后再于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h；尼莫地平組在復(fù)氧時加入2.1 mg/L的尼莫地平，梓葛低（12.5 mg/L）、中（24.5 mg/L）、高（49.0 mg/L）劑量組，復(fù)氧時分別加入相應(yīng)劑量的梓葛凍干粉針劑，其余過程同模型組。

梓葛凍干粉針劑和尼莫地平均以生理鹽水溶解，分別按12.5 mg/L、24.5 mg/L及49.0 mg/L和2.1 mg/L加入培養(yǎng)基中。在復(fù)氧時，各給藥1次。同時正常組和模型組給予相同體積的生理鹽水。每組均設(shè)復(fù)孔6個。

1.2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的測定 采用MTT法。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，96孔板每孔加入5 g/L的MTT溶液各15 μL，于培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下孵育4 h后，棄去MTT液，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩器輕輕混勻10min后，以酶標(biāo)儀，490 nm波長，檢測A值。

1.2.4 NO、MDA含量和SOD活力的測定 復(fù)氧2 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次。加入300 μL細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min后，高速冷凍離心機離心10 min，取100 μL細(xì)胞上清液測定按試劑盒說明書操作，用硫代巴比妥酸顯色法、硝酸還原酶法和黃嘌呤氧化酶法分別測定細(xì)胞MDA、NO含量和SOD活力。

1.2.5 LDH釋放量的測定 復(fù)氧2 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑盒說明操作，用2，4-二硝基苯肼顯色法測定LDH釋放量。

1.2.6 蛋白提取及濃度測定 參照文獻(xiàn)［8］方法，將收集的細(xì)胞離心沉淀，吸干水分后，加入150 μL冰冷的細(xì)胞裂解液于冰上勻漿，冰浴30 min；4℃下12000 rpm，離心10min；取上清（含胞膜和胞漿裂解物）置于4℃預(yù)冷的Ep管中，液氮速凍，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ每捡R斯亮藍(lán)法測定總蛋白濃度。

1.2.7 Western blot檢測 取裂解液上清，分別加入5倍上樣緩沖液于沸水浴中加熱5 min后離心，加入已灌制好的10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，每泳道上樣40μg；電泳結(jié)束，將分離蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；TBST洗膜，隨后將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1 h，然后用一抗工作液孵育，4℃過夜（16 h～18 h）；TBST充分洗膜后，用HRP標(biāo)記二抗工作液37℃孵膜；TBST洗膜，將膜移入ECL工作液中，顯影，壓片，用Quantity one 4.5.1版圖像分析軟件（Bio-Rad公司產(chǎn)品）分析條帶的光密度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參條帶比值作為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量，試驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 梓葛凍干粉針劑對缺氧-復(fù)氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力、MDA、NO含量、LDH釋放量和SOD活性的影響

結(jié)果見表1。由表1可見，與正常組相比，模型組A值、SOD活性顯著性降低（P<0.05）；MDA和NO含量以及LDH釋放量均顯著性升高（P<0.05）。與模型組比較，梓葛低劑量組A值顯著高于模型組（P<0.05）；梓葛低、中劑量組MDA和LDH含量顯著降低（P<0.05）；梓葛低劑量組NO含量顯著降低（P<0.05）；梓葛凍干粉針劑的各劑量組SOD活性均顯著提高（P<0.05）。

表1 梓葛凍干粉針劑對缺氧-復(fù)氧損傷HUVECs的MDA、NO含量和SOD、LDH活性及細(xì)胞活力的影響 （±s）

表1 梓葛凍干粉針劑對缺氧-復(fù)氧損傷HUVECs的MDA、NO含量和SOD、LDH活性及細(xì)胞活力的影響 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.05；與模型組比較，2）P<0.05

LDH（U/g）正常組 - 1.14±0.56 0.18±0.06 5.35±0.82 14.18±0.79 4.85±0.46模型組 - 0.68±0.161） 0.41±0.061） 12.12±0.781） 8.75±0.851） 11.25±1.141）尼莫地平組 2.1 0.88±0.122） 0.23±0.082） 7.82±0.792） 14.95±0.932） 5.89±0.402）梓葛低劑量組 12.5 0.87±0.342） 0.26±0.092） 8.16±0.362） 12.88±1.022） 6.11±1.282）梓葛中劑量組 24.5 0.79±0.28 0.31±0.122） 10.08±0.80 12.50±0.782） 8.45±0.862）梓葛高劑量組 49.0 0.75±0.29 0.36±0.11 12.03±0.97 10.98±0.862） 9.49±0.95組別 劑量（mg/L）MTT（A）MDA（mmol/g）NO（mmol/g）SOD（U/mL）

2.2 梓葛對缺氧-復(fù)氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見表2、圖1。

表2 梓葛凍干粉針劑對缺氧-復(fù)氧損傷HUVECs的Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表2 梓葛凍干粉針劑對缺氧-復(fù)氧損傷HUVECs的Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

組別 劑量（mg/L） caspase-3 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax正常組 - 0.35±0.01 0.89±0.03 0.22±0.01 4.05±0.20模型組 - 0.56±0.021） 0.60±0.061） 0.44±0.021） 1.37±0.131）尼莫地平組 2.1 0.40±0.013） 0.74±0.033） 0.29±0.013） 2.53±0.093）梓葛低劑量組 12.5 0.55±0.01 0.69±0.052） 0.40±0.003） 1.75±0.123）梓葛中劑量組 24.5 0.42±0.013） 0.70±0.023） 0.33±0.013） 2.16±0.123）梓葛高劑量組 49.0 0.44±0.023） 0.67±0.03 0.41±0.012） 1.61±0.072）

由表2、圖1可以看出，與正常組比較，模型組caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，Bcl-2/Bax顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，梓葛中、高劑量組caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；梓葛低、中劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）；梓葛各劑量組Bax蛋白水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）；同時梓葛各劑量組Bcl-2/Bax均顯著提高（P<0.05，P<0.01）。

3 討論

本實驗研制的梓葛凍干粉針劑在于提供一種治療腦缺血性疾病的中藥有效成分復(fù)方藥物制劑，組方依據(jù)源于《千金方》羌活湯（羌活、葛根、芍藥、桂心、麻黃、生地黃、甘草、生姜）治療中風(fēng)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》也提到地黃能“除痹”，葛根能治“諸痹”，葛根因具有升騰發(fā)散之性，能竄達(dá)上下，故使氣血通暢，脈絡(luò)得開。故葛根與地黃配伍，一內(nèi)一外，相輔相成，可針對中風(fēng)、痹證進(jìn)行治療。

依據(jù)機體內(nèi)皮細(xì)胞缺血-再灌注損傷過程中組織間液的變化，包括缺氧、乳酸堆積、酸中毒和糖耗竭等，本實驗采用Krebs液制備細(xì)胞損傷模型，模擬整體動物的缺血-再灌注損傷過程。

近年研究發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠阻止線粒體膜電位的喪失，提高內(nèi)源性抗氧化能力，降低自由基生成，從而抑制由1-甲基-4-苯基吡啶離子介導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷［9］。葛根素對小鼠的缺氧損傷具有顯著延長存活時間的作用，以及對小鼠缺氧后再暴露所引起的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生也有顯著的抑制作用［10］。實驗中缺氧-復(fù)氧后，LDH釋放量顯著增加，A值降低，顯示細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，細(xì)胞的存活率降低；同時細(xì)胞MDA和NO含量升高，SOD活性顯著下降，表明自由基大量產(chǎn)生與缺氧-復(fù)氧損傷有關(guān)。給予梓葛凍干粉針劑后，梓葛凍干粉針劑組LDH釋放量、MDA和NO含量顯著降低，細(xì)胞活力提高，SOD活性顯著提高，表明梓葛凍干粉針劑可提高細(xì)胞抗氧化的能力，抵抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷過程中的氧化損傷，對缺氧-復(fù)氧損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有直接的保護作用。

Anuradha C等［11］發(fā)現(xiàn)抗氧化劑的保護作用是通過維護線粒體跨膜壓、拮抗caspase-3激活和上調(diào)Bcl-2實現(xiàn)的。相關(guān)研究表明，葛根素能通過降低caspase-3蛋白的表達(dá)水平，增強Bcl-2蛋白表達(dá)水平［12］，上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的比值等［13］，實現(xiàn)對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用。本實驗中，藥物干預(yù)后，梓葛凍干粉針劑顯著提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2/Bax比值。表明梓葛凍干粉針劑可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白和下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2/Bax，阻斷caspase-3的激活，從而對缺血再灌注所造成的損傷起到一定的保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)梓葛凍干粉針劑可調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，對缺氧-復(fù)氧損傷有明顯的保護作用。其機制可能通過抑制細(xì)胞自由基的產(chǎn)生、提高抗氧化能力、調(diào)控Bcl-2家族成員、升高Bcl-2/Bax、拮抗Caspase-3的激活，抑制細(xì)胞凋亡，對缺血再灌注損傷起到保護作用。本研究首次報道梓醇、葛根素配伍合用對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模擬的體內(nèi)缺血再灌注損傷模型的保護作用，對于更多更確切的保護機制將是課題組進(jìn)一步探究的內(nèi)容。

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