黃連配伍吳茱萸對(duì)大鼠紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

周喜芬，陳繼蘭，秦玉花，曾躍琴，黃秀深

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137）

黃連性味苦寒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，歷代醫(yī)家在長期的醫(yī)療實(shí)踐中對(duì)黃連有了充分的認(rèn)識(shí)和使用經(jīng)驗(yàn)，常用于諸熱、瘡瘍、濕熱之證。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從東漢至宋代近10個(gè)世紀(jì)間，黃連都是方書中的重要藥物，大致有5%左右的方劑含有黃連，平均每20個(gè)處方就有1個(gè)含黃連的處方［1］。從《神農(nóng)本草經(jīng)》開始，對(duì)黃連苦寒藥性的認(rèn)識(shí)持續(xù)至今沒有改變，過用有損胃傷脾之弊，但都未明確提出黃連有毒之說。1978年10月6日，新加坡政府衛(wèi)生部發(fā)布文告，懷疑黃連對(duì)葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）缺陷者可致嚴(yán)重的溶血性黃疸［2-3］，宣布黃連或川連作為毒物管制，引起廣泛的關(guān)注和爭議。我們?cè)O(shè)想如果按現(xiàn)代一些學(xué)者的研究和認(rèn)識(shí)，黃連會(huì)引起G6PD缺陷者溶血性黃疸，那么黃連作用于正常機(jī)體是否也會(huì)引起紅細(xì)胞溶血呢？故而本實(shí)驗(yàn)使用不同劑量的黃連及黃連配伍吳茱萸較長時(shí)間地作用于正常大鼠，研究對(duì)正常大鼠紅細(xì)胞滲透脆性及谷胱甘肽含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，雌雄各半，體重180 g～220 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 黃連和吳茱萸購自成都市“同仁堂”大藥房，品質(zhì)優(yōu)良。制劑時(shí)稱取所需藥材，加5倍量水浸泡30 min，電爐加熱至沸，20 min后過濾。濾渣再加3倍量水，加熱至沸，20 min后過濾。合并兩次濾液，用水浴鍋60℃恒溫加熱，濃縮至相當(dāng)于藥材1 g/mL的水煎液，冰箱保存?zhèn)溆谩９入赘孰脑噭┖校暇┙ǔ缮锕こ萄芯克a(chǎn)，批號(hào)：2005072。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 721分光光度儀（上海第三分析儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 將SD大鼠按體重分層隨機(jī)分為空白對(duì)照組、小劑量黃連組、大劑量黃連組和大劑量黃連配伍吳茱萸組4組，每組10只。灌胃分別給予相應(yīng)的藥物煎劑。小劑量黃連組0.05 g/100 g體重；大劑量黃連組0.15 g/100 g體重；大劑量黃連配伍吳茱萸組0.175 g/100 g體重；空白對(duì)照組給予等量水。每天1次，共給藥15 d。給藥結(jié)束后，大鼠禁食24 h，不禁水。從股動(dòng)脈采血3 mL，裝入抗凝管中。

1.2.2 紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn) 采用改良san-ford法，并以隱血試驗(yàn)法檢定始溶血的鹽水濃度［4］。精密稱取氯化鈉，蒸餾水溶解，分別配成0.68%～0.32%的NaCl溶液，相鄰濃度差0.04%，共10個(gè)鹽水梯度。實(shí)驗(yàn)時(shí)，10只試管分裝不同濃度鹽水，每管2 mL。每管滴入全血1滴，輕輕混勻，置37℃水浴中放置4 h后取出，用隱血試驗(yàn)方法［5］在磁皿中檢測，顯示陽性反應(yīng)的最高鹽水濃度即作為始溶血的鹽水濃度。

1.2.3 谷胱甘肽含量測定 肝素抗凝全血制成1∶99溶血液。用721分光光度儀比色定量檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)資料中的數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析處理，數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的影響結(jié)果見表1。

表1 藥物對(duì)大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的影響 （±s）

表1 藥物對(duì)大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.01

組別 n 始溶血鹽水濃度（%）空白對(duì)照組 8 0.5600±0.0565小劑量黃連組 8 0.5900±0.0282大劑量黃連組 8 0.6350±0.05421）大劑量黃連配伍吳茱萸組 7 0.5943±0.0538

由表1可見，與空白對(duì)照組比較，大劑量黃連組始溶血鹽水濃度顯著升高（P<0.01）。

2.2 藥物對(duì)大鼠紅細(xì)胞谷胱甘肽含量的影響

結(jié)果見表2。

表2 藥物對(duì)大鼠紅細(xì)胞谷胱甘肽含量的影響 （±s）

表2 藥物對(duì)大鼠紅細(xì)胞谷胱甘肽含量的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.01；與大劑量黃連配伍吳茱萸組比較，2）P<0.05

組別 n GSH含量（mg/mL全血）空白對(duì)照組 8 45.8150±5.9034小劑量黃連組 8 42.1449±3.2536大劑量黃連組 8 36.5503±5.74251）2）大劑量黃連配伍吳茱萸組 7 44.9329±3.6712

由表2可以看出，各給藥組大鼠紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量均有下降趨勢。與空白對(duì)照組比較，大劑量黃連組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與大劑量黃連配伍吳茱萸組比較，大劑量黃連組大鼠紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量顯著下降（P<0.05）。

3 討論

正常狀態(tài)下紅細(xì)胞內(nèi)的滲透壓與血漿滲透壓大致相等，這對(duì)保持紅細(xì)胞的形態(tài)甚為重要。將機(jī)體紅細(xì)胞置于等滲溶液（0.9%的NaCl溶液）中，它能保持正常的大小和形態(tài)。若將紅細(xì)胞置于低滲NaCl溶液中，水分進(jìn)入細(xì)胞，紅細(xì)胞膨脹變成球形，可至膨脹而破裂，血紅蛋白釋放入溶液中，稱為溶血。臨床以0.45%NaCl～0.3%NaCl溶液為正常人體紅細(xì)胞的脆性（也稱抵抗力）范圍。如果紅細(xì)胞放在高于0.45%/NaCl溶液中時(shí)即出現(xiàn)破裂，表明紅細(xì)胞的脆性大，抵抗力小；相反，放在低于0.45%NaCl溶液中時(shí)才出現(xiàn)破裂，表明脆性小，抵抗力大。

紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)是測定紅細(xì)胞對(duì)低滲NaCl溶液的耐受能力。耐受力高者紅細(xì)胞不易破裂，即其脆性低，穩(wěn)定性好。通過測定不同藥物組SD大鼠紅細(xì)胞的始溶血鹽水濃度，以判斷黃連劑量的大小以及配伍對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響。

谷胱甘肽（GSH）是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種小分子物質(zhì)，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及磷酸丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，使人體獲得高能量。它能激活各種酶，如體內(nèi)的巰基（-SH）酶等。足量的GSH可以使紅細(xì)胞穩(wěn)定，維持紅細(xì)胞膜蛋白的完整性，保護(hù)血紅蛋白的巰基及紅細(xì)胞內(nèi)的其他含巰基的酶免受氧化性傷害。反之，紅細(xì)胞失去GSH保護(hù)，容易遭受氧化性傷害，造成溶血現(xiàn)象。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）是一種參與磷酸己糖旁路代謝的紅細(xì)胞酶。紅細(xì)胞的生存及功能要求血紅蛋白、酶和紅細(xì)胞膜避免遭受氧化性損害，依賴保護(hù)性系統(tǒng)的完整性。G6PD缺乏可使紅細(xì)胞內(nèi)GSH生成減少，穩(wěn)定性下降，所以測定GSH含量能間接反映出體內(nèi)G6PD的含量和活性，以及紅細(xì)胞的穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小劑量黃連即相當(dāng)于人常用劑量6 g且給藥時(shí)間為15 d時(shí)，對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性和谷胱甘肽含量的影響與空白對(duì)照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)黃連劑量用到相當(dāng)于人服用劑量18 g，給藥時(shí)間為15 d時(shí)，此屬超常大劑量較長時(shí)間使用，明顯影響了紅細(xì)胞滲透脆性且使紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量下降，導(dǎo)致了紅細(xì)胞溶血。而當(dāng)黃連仍用18 g，但和吳茱萸以6∶1比例配伍時(shí)，對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性和谷胱甘肽含量影響較小，與空白對(duì)照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即說明黃連和吳茱萸配伍，即使黃連使用劑量較大，也不易引起紅細(xì)胞滲透脆性增加和谷胱甘肽含量降低，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。

2010 版《中國藥典》規(guī)定黃連劑量為 2 g～5 g［6］，故而，根據(jù)《藥典》規(guī)定劑量使用黃連是安全的，不會(huì)影響正常血紅細(xì)胞的滲透脆性和谷胱甘肽含量。黃連與吳茱萸配伍，名為左金丸，是出于朱丹溪《丹溪心法·火六》的名方。黃連性味苦寒，六倍用量于吳茱萸，配以辛熱的吳茱萸可減輕黃連苦寒?dāng)∥钢住６幹裕粶匾缓耆喾矗瑓擒镙瞧鸱醋糁谩膶?shí)驗(yàn)結(jié)果來看，二藥合用，可以顯著地拮抗較高濃度黃連對(duì)紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響，說明黃連和吳茱萸配伍具有“減毒”作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)黃連單方在全部含黃連的方劑中只占2%左右，一書中最多不超過6%。說明古人常用含黃連的方劑，極少應(yīng)用黃連單方，而且劑量較小的經(jīng)驗(yàn)是有深意的。

［1］陳馥馨，高曉山.含黃連方劑及黃連配伍藥的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)［J］.中成藥，1997，19（8）：40-41.

［2］楊守業(yè)，高曉山.黃連“誘發(fā)和加重”新生兒黃疸的研究概況［J］.中國中藥志，1996，21（3）：187.

［3］高曉山.黃連致溶血性黃疸毒性的提出和爭議［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，1996，3（6）：3，3（7）：6.

［4］林娜，高曉山，李建榮，等.黃連和小檗堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性G6PD缺陷大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的影響［J］.中國中藥雜志，1998，23（9）：562.

［5］李其英，徐勉忠，孔祥云.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)［M］.武漢：湖北人民出版社，1981：129.

［6］中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：285-286.