黃連溫膽湯對糖尿病小鼠海馬神經凋亡的影響

張衛華 ，張維新，劉華東，石富國，陳志明 ，劉 舟

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京210046；2.寧夏中衛市人民醫院，寧夏中衛755000；3.中國藥科大學，江蘇南京211198）

糖尿病腦病是近幾年受到研究者重視的糖尿病慢性中樞神經系統并發癥，表現為癡呆樣的學習和記憶功能障礙［1］。盡管糖尿病腦病的發病機制目前還沒有完全明確，但研究表明，神經細胞的變性、凋亡導致中樞神經細胞的數目減少是發生認知功能障礙的重要病理基礎［2］。黃連溫膽湯出自清代陸廷珍《六因條辨》，由黃連、半夏、陳皮、茯苓、枳實、竹茹、炙甘草、生姜組成，具有清化痰熱之功，可用于治療痰熱內擾所致的糖尿病并發癥［3］，但應用于糖尿病腦病卻少見報道。本研究通過黃連溫膽湯干預治療2型糖尿病小鼠后，原位末端標記法（TUNEL法）檢測海馬神經元的凋亡，免疫組織化學法檢測caspase-3蛋白的表達，以期探討黃連溫膽湯對2型糖尿病小鼠海馬神經凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.3 儀器與設備 酶標儀（Thermo，美國）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；大容量低溫離心機（KUBOTA，日本）；96孔培養板（Costar，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與給藥 小鼠按體重隨機分為空白組（10只）和造模組，分別喂養普通飼料和高糖高脂飼料。喂養4 w后，造模組小鼠腹腔注射STZ 100 mg/kg，保證所有注射在15 min內完成。注射72 h后，禁食不禁水12 h，采用葡萄糖氧化酶法測量小鼠空腹血糖，空腹血糖值>11 mmol/L者為2型糖尿病小鼠，去除血糖值不達標小鼠，按照血糖值隨機分為二甲雙胍組（0.25 g/kg）、模型組、黃連溫膽湯低劑量組（5 g/kg）、中劑量組（10 g/kg）和高劑量組（20 g/kg），每組 10只。造模成功后各給藥組連續灌胃給藥3 w，空白組和模型組給予等體積蒸餾水。

1.2.2 TUNEL法檢測海馬神經細胞凋亡、免疫組織化學法檢測caspase-3表達 各組取5只小鼠經1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，開胸暴露心臟，經左心室插管，同時剪開右心耳，快速灌注4℃保存的生理鹽水，至肝臟變白后，改灌注10%中性甲醛固定液，固定至小鼠全身僵直，切取腦組織后部分，置于4%多聚甲醛固定液24 h。進行石臘包埋后，將石蠟組織切片，按TUNEL、caspase-3試劑盒說明進行染色。各切片在400×光鏡視野下隨機選取3個不重疊區域，計算TUNEL、caspase-3陽性細胞數。

1.3 統計學方法

所有數據以均數±標準差（Mean±SD）表示，采用單向方差分析法（ANOVA）對實驗數據進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

TUNEL和caspase-3陽性細胞的表達，結果見圖1、圖2、表 1。

1.1.1 實驗動物 清潔級ICR小鼠，4 w齡，體重18 g～22g，江蘇省南京市青龍山動物養殖場提供，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001。動物分籠飼養，保持12 h晝夜節律，室溫（22±1）℃，自由飲水攝食。

1.1.2 藥物與試劑 二甲雙胍購自上海醫藥（集團）有限公司信宜制藥廠；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國sigma公司；葡萄糖測定試劑盒購于上海榮盛生物藥業有限公司；TUNEL、caspase-3檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。黃連溫膽湯組成藥物均購于南京先聲藥店丁家橋店，并經中國藥科大學中藥資源開發教研室秦民堅教授鑒定。藥物浸泡30 min后，加8倍量的雙蒸水，從煮沸起計時1 h。倒出藥液后，重復加4倍水煎煮0.5 h兩次。藥液用8層紗布過濾2次，60℃水浴旋蒸至濃度為2g/mL（按生藥量計算），4℃保存。飼料：高糖、高脂、高熱量飼料的配方∶蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶豬膽酸鹽∶普通飼料粉=30∶20∶4∶2∶0.05∶63，由江蘇省南京市青龍山動物養殖場提供。

圖1 各組小鼠海馬區TUNEL染色結果（400×）

圖2 各組小鼠海馬區caspase-3的表達（400×）

由圖1～圖2可見，海馬神經組織TUNEL染色后陽性細胞呈棕褐色，免疫組織化學法處理caspase-3后陽性細胞呈棕黃色。由表1可以看出，與空白組比較，模型組小鼠海馬TUNEL與caspase-3陽性細胞數顯著增多（P<0.01）；與模型組比較，黃連溫膽湯中、高劑量組及二甲雙胍組小鼠海馬TUNEL與caspase-3陽性細胞數顯著降低（P<0.01）。

表1 黃連溫膽湯對小鼠海馬神經凋亡細胞和caspase-3表達的影響 （±s）

表1 黃連溫膽湯對小鼠海馬神經凋亡細胞和caspase-3表達的影響 （±s）

注：與空白組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.01

組別 n TUNEL（個） caspase-3（個）空白組 15 10.75±2.66 11.05±3.14模型組 15 38.63±10.991） 61.86±21.571）二甲雙胍組 15 17.88±4.692） 21.97±8.892）黃連溫膽湯低劑量組 15 32.50±8.84 43.64±15.88黃連溫膽湯中劑量組 15 15.25±5.402） 24.76±7.292）黃連溫膽湯高劑量組 15 14.13±5.122） 18.31±5.322）

3 討論

糖尿病腦病是糖尿病最為常見的慢性并發癥之一，主要表現為慢性進行性的認知功能障礙，尤其是學習和記憶能力的降低［4-5］。中樞神經系統中海馬是與學習、記憶、認知有關的重要結構，海馬區域神經細胞的變性、凋亡與其功能障礙有關［6］。本課題在研究中發現黃連溫膽湯可以顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖（FBG）［7］，也可明顯提高糖尿病小鼠的學習記憶認知能力［8］。

細胞凋亡的主要檢測技術包括形態學方法（如光學顯微鏡、電子顯微鏡和流式細胞儀）、生物化學方法（如DNA ladder）和分子生物學方法（如 TUNEL 法）［7］。TUNEL 法是目前最常用的組織樣品凋亡細胞的檢測手段，但由于該法對能否區分凋亡細胞和壞死細胞尚存爭議，即可能存在假陽性的缺點。因此，多數學者采用TUNEL法與相關基因表達同步測定相結合的方法進行研究。目前認為caspase是一切凋亡信號轉導的共同通路，在caspase級聯反應中caspase-3被認為是caspase級聯反應中最關鍵的效應蛋白酶，是細胞凋亡過程中的終末剪切酶，一旦被激活，凋亡常難以避免，該酶是否被激活也是鑒別細胞凋亡與壞死的主要依據［9］。因此，本研究在使用TUNEL法檢測腦組織凋亡細胞的基礎上，同步進行caspase-3基因表達的免疫組織化學檢測，一方面克服單純TUNEL法可能出現假陽性的缺點，另一方面能更深入研究細胞凋亡的作用機理。研究結果顯示，黃連溫膽湯能顯著抑制海馬神經凋亡，減少caspase-3蛋白的表達，說明黃連溫膽湯參與了依賴于casepase-3蛋白的神經細胞凋亡的保護。

總之，黃連溫膽湯能顯著改善2型糖尿病小鼠的認知功能，其機制可能是通過減少caspase-3蛋白的表達，從而抑制海馬神經凋亡。由于糖尿病腦病發病機制復雜，中藥復方多成分多靶點的特點，黃連溫膽湯治療糖尿病腦病的具體機制有待進一步深入研究。

［1］Sima A A.Diabetes underlies common neurological disorders［J］.Ann Neurol，2004，56（4）：459-461.

［2］張紅.糖尿病腦病研究進展［J］.臨床薈萃，2003，18（8）：478-47.

［3］王永山.溫膽湯治療糖尿病并發癥芻議［J］.遼寧中醫藥大學學報，2009，11（4）：158-160.

［4］Biessels G J，vander Heide L P，Kamnal A，et al.Ageing and diabetes：implications for brain function［J］.Eur J Pharmacology，2002，441（l/2）：1-14.

［5］Trudean F，Gagnon S，Massicotte G.Hippocampal synaptic plasticity and glutamate receptor regulation：influences of diabetes mellitus［J］.Eur J Pharmacology，2004，490（l/3）：177-186.

［6］Savitz S I，Rosenbaum D M.Apoptosis in neurological disease［J］.Neurosurgery，1998，42（3）：555-574.

［7］張衛華，劉華東，劉舟，等.黃連溫膽湯對2型糖尿病小鼠血糖的影響［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011，13（8）：118-119.

［8］張衛華，劉舟，石富國，等.黃連溫膽湯對2型糖尿病小鼠學習記憶及海馬神經細胞形態的影響［J］.時珍國醫國藥，2012，23（4）：948-949.

［9］傅桂蓮.分子生物學檢驗技術［M］.北京：人民衛生出版社，2003：201-213.