三圣湯及其固體湯劑的HPLC指紋圖譜比較

林 淵，周良良，羅永東

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院方劑學(xué)重點學(xué)科，福建福州350122）

三圣湯出自清·陳士鐸的《辨證錄》，由杜仲、白術(shù)、山茱萸三味藥組成。主要用于治療腎虛腰痛［1］。但傳統(tǒng)飲片湯劑制作繁瑣，攜帶服用不便，制約了中藥湯劑的應(yīng)用范圍。固體湯劑是在湯劑改革的基礎(chǔ)上，開發(fā)研制的一種新劑型，改進傳統(tǒng)湯劑的煎煮方式和現(xiàn)代自動化機械制作相結(jié)合的一種可供沸水泡服的固體制劑，供臨床配方使用［2］。它既保持了傳統(tǒng)湯劑吸收快，起效迅速，能根據(jù)病情變化而隨證加減，能較全面靈活兼顧到不同病人或各具體病變階段的特殊性等優(yōu)點，又克服了湯劑煎煮工藝繁瑣，耗時長，服用不便等缺點。通過本實驗對三圣湯及其固體湯劑的HPLC圖譜進行比較，以期總結(jié)出三圣湯及其固體湯劑在化學(xué)成分上的差異性。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Waters高效液相色譜儀（Alliance 2695四元泵及自動進樣系統(tǒng)，2998 PAD檢測器，Empower 2色譜工作站），F(xiàn)A2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），CR-20S電磁爐（廣東容聲電器有限公司），DH01-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實驗設(shè)備有限公司），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），CLF-04C型200 g密封型搖擺式中藥粉碎機（廣州大祥電子機械設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材與試劑

杜仲（批號：10022304，產(chǎn)地：湖北）、白術(shù)（批號：09032401，產(chǎn)地：浙江）、山茱萸（批號：09071004，產(chǎn)地：浙江）均購于福州回春中藥飲片廠有限公司。松脂醇二葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111537-201103），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110753-200413）均購自中國藥品生物制品檢定所。分析純甲醇、色譜純乙腈，醋酸為優(yōu)級純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長254 nm，流動相：乙腈：0.4%醋酸水溶液，梯度洗脫：0 min～30 min 5%乙腈，30 min～50 min 15%乙腈，50 min～80 min 40%乙腈，80 min～85 min 100%乙腈，流速0.6 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量 5 μL。

2.2 供試品溶液制備

三圣湯：按處方量比例稱取藥材飲片19 g，加自來水煎煮2次，濾過合并濾液，蒸干后加25 mL甲醇超聲30 min溶解，濾過，取濾液15 mL甲醇定容至50 mL，過微孔濾膜即得。三圣湯固體湯劑供試品：按處方量比例稱取藥材飲片19 g，以固體湯劑制備工藝制備后，用沸水200 mL沖泡，濾過，濾液蒸干后用25 mL甲醇超聲溶解30 min，濾過，精密吸取15 mL濾液加甲醇定容至50 mL，過微孔濾膜即得。藥材：按處方量比例分別稱取各藥材粉末，加入甲醇25 mL超聲30 min，濾過，精密吸取濾液15 mL甲醇定容至50 mL，過微孔濾膜即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗 取三圣湯固體湯劑供試品溶液，連續(xù)進樣5次，對主要的色譜峰進行了考察，計算各保留時間的RSD為0～0.3%，各峰面積的RSD為0.5%～3.0%。并計算相似度均大于0.95。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 取同一批藥材制成的固體湯劑供試品溶液分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進行測定 HPLC色譜圖，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0～1.9%，各共有峰相對峰面積的RSD為0.5%～3.6%，相似度軟件進行相似度計算得各相似度均大于0.97。表明樣品在24 h里穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性實驗 取同一批藥材，按“2.2三圣湯固體湯劑供試品”項下平行操作，制備5份固體湯劑供試品溶液，測定HPLC色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間的RSD為0～1.5%，相對峰面積的RSD為0.6%～5.0%，用相似度軟件計算得相似度分別為 0.943、0.968、0.996、0.996、0.996，表明該法重現(xiàn)性良好。

2.4 結(jié)果

2.4.1 指紋圖譜中各峰的確認(rèn) 以254 nm為檢測波長，從三圣湯及其固體湯劑的HPLC色譜圖中共分辨出24個峰，經(jīng)過在相同波長下與單味藥材提取液的色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，1、2、3 號峰為溶劑峰不予考慮，5、18、21、22 號峰為三味藥材的共有峰，此外15、20、24為杜仲和山茱萸的共有峰，其中19號峰為綠原酸，7、8號峰為白術(shù)和山茱萸共有。杜仲特有 10、11、12、14、16、23 號峰，其中 23 號峰為松脂醇二葡萄糖苷，山茱萸特有9、17、19號峰，19號峰為綠原酸。6號和13號峰在單味藥材中沒有體現(xiàn)，可能是在合煎過程中新產(chǎn)生的兩種成分，由于色譜分離條件的限制，以上共有峰及未知峰還無法具體區(qū)分。結(jié)果見圖1、圖2。

2.4.2 三圣湯及其固體湯劑指紋圖譜比較 從三圣湯及其固體湯劑的指紋圖譜直觀比較來看，二者圖譜有一定的相似性，也存在著差異性。從保留時間和各峰的峰面積來看，各峰保留時間接近，但是峰面積有一定的差異性，以固體湯劑的等面積為大。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版（中國藥典委員會）對二者的相關(guān)性進行分析，分析結(jié)果為二者的相關(guān)系數(shù)為0.966。

3 討論

流動相的選擇：分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%醋酸水溶液和乙腈-0.4%醋酸水溶液，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.4%醋酸水溶液為流動相分離效果最佳，加入緩沖液可以使酸性成分和堿性成分得到較好分離。

采用二極管陣列檢測器進行200 nm～400 nm波長范圍掃描，比較了不同波長下三圣湯及其固體湯劑的HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)在254 nm下所得圖譜基線平穩(wěn)，分離較好，紫外吸收響應(yīng)值合適，反應(yīng)的信息較多，各峰都較清晰，故選擇最佳波長為254 nm。

用于制備三圣湯及其固體湯劑所用藥材為同一批次藥材，可以排除因藥材不均而引起的色譜圖差異。根據(jù)三圣湯固體湯劑和飲片湯劑的HPLC指紋圖譜比較結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者的HPLC圖譜相似度較高，保留時間差異比較小，相對面積存在一定差異。從中提取出24個峰，其中19號峰為綠原酸，23號峰為松脂醇二葡萄糖苷，由于松脂醇二葡萄糖苷為木脂素類物質(zhì)難溶于水所以在煎煮過程中溶出效率比較低。

三圣湯及其固體湯劑在化學(xué)組成上相似，從整體上看二者的相似度較高，通過本次實驗，對固體湯劑這種新劑型的研究具有積極意義，但要確定其與傳統(tǒng)湯劑存在差異，還需結(jié)合藥理藥效及臨床效果來進行判斷。

［1］林淵，周良良，吳水生.對中藥湯劑劑型改革研究的思考［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（5）：317-320.

［2］馮明芬，馮樹林.三圣湯新用驗案四則［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，36（4）：248.