STAT3基因與MMP-2、MMP-9在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系

祝立和　盧洪勝　周凱敏　陳國(guó)榮

[摘要] 目的 磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3蛋白與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）關(guān)系密切，EMT需要降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是降解ECM和基底膜（BM）的主要執(zhí)行者。本研究從EMT角度探討磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）基因與MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其意義。方法 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)30例新鮮乳腺癌及癌旁組織標(biāo)本的STAT3基因的表達(dá)，并以免疫組化方法檢測(cè)70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中pSTAT3、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，分析pSTAT3蛋白與MMP-2、MMP-9表達(dá)的關(guān)系及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 STAT3mRNA在乳腺癌標(biāo)本中相對(duì)濃度為0.526±0.312，癌旁組織為0.197±0.161，兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05）；pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.9%、72.8%、67.1%，明顯高于正常乳腺組織19.2%、26.9%、34.6%，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 均< 0.05）。MMP-2、MMP-9在不同年齡、腫瘤大小、ER、PR表達(dá)組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間，MMP-2、MMP-9表達(dá)有顯著差異（P均<0.05）。 結(jié)論 STAT3基因及pSTAT3 與 MMP-2、MMP-9表達(dá)在乳腺癌中呈正相關(guān)，STAT3基因及pSTAT3和MMP-2 、MMP-9的高表達(dá)與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，STAT3基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9的表達(dá)介導(dǎo)EMT從而促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；熒光定量PCR

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.9[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）29-0058-04

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全球每年新發(fā)的120多萬(wàn)例乳腺癌患者中，約有20萬(wàn)死于乳腺癌的轉(zhuǎn)移[1]。而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生被認(rèn)為是上皮來(lái)源的癌細(xì)胞發(fā)生局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的首要事件。EMT是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)雜過(guò)程，在此過(guò)程中上皮細(xì)胞的極性消失、遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)同時(shí)伴有上皮細(xì)胞標(biāo)志物的丟失而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的過(guò)度表達(dá)[2]。目前較為公認(rèn)的調(diào)控EMT的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子主要包括Snail、Smad相互作用蛋白（smad interactionprotein 1，SIP1）和Twist等，新近研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activators of transcription 3，STAT3）信號(hào)活化也與腫瘤的EMT有關(guān)[3，4]。我們前期的研究也證實(shí)在浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管癌中pSTAT3與EMT密切相關(guān)，活化的STAT3可能通過(guò)介導(dǎo)EMT促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的侵襲轉(zhuǎn)移[5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化需要降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解ECM和基底膜（basement membrane，BM）的主要執(zhí)行者。我們?cè)O(shè)計(jì)通過(guò)檢測(cè)STAT3基因及MMPs重要家族成員MMP-2，9蛋白的表達(dá)，旨在從EMT角度繼續(xù)探討STAT3基因與MMP-2，9蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本收集

收集溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院與溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2011年1～12月行乳腺根治術(shù)切除的有完整臨床及病理資料的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病例70例為研究組，26例癌旁正常組織為對(duì)照組。另取術(shù)中冰凍證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的新鮮乳腺癌及癌旁組織30例，液氮凍存，備RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

手術(shù)后盡快地收集組織標(biāo)本，避免RNA降解。剔除腫瘤的壞死部分、肌肉及脂肪，確保取材的質(zhì)量。在盡可能遠(yuǎn)離腫瘤的部位（>2 cm）取癌旁組織。先將標(biāo)本置入凍存管于液氮中速凍，然后移入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

標(biāo)本在盛有液氮的研缽中碾碎后，按RNAeasy試劑盒說(shuō)明提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)和甲醛瓊脂糖變性電泳對(duì)提取的總RNA進(jìn)行純度和含量鑒定。OD260/OD280值顯示在1.8～2.0之間。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以上步驟均按試劑盒說(shuō)明操作。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

1.5免疫組織化學(xué)

所有標(biāo)本經(jīng)10％中性甲醛固定，石蠟包埋，以4 m厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟和水化后，免疫組織化學(xué)Envision二步法染色按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判斷：pSTAT3蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位在胞核，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，可作為內(nèi)對(duì)照。pSTAT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10％為陽(yáng)性，<10％為陰性。MMP-2、MMP-9蛋白檢測(cè)以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，對(duì)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度按無(wú)著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別打分0，l，2，3分；著色面積按無(wú)著色、著色2/3分別評(píng)0，l，2，3分。根據(jù)兩項(xiàng)得分之和判斷結(jié)果：<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。每張切片選擇有代表性的區(qū)域，在100倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)5個(gè)視野，取其平均值以避免隨意性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1 STAT3mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)

2.2 pSTAT3、MMP-2和MMP-9蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)

3討論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是近年細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，由于其與胚胎形成、組織再生以及上皮細(xì)胞腫瘤惡性進(jìn)展等方面均存在重要聯(lián)系，因而EMT形成機(jī)制的相關(guān)研究正成為臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域十分活躍的課題，對(duì)于眾多疾病的防治具有深遠(yuǎn)影響。發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞在經(jīng)歷了短暫的結(jié)構(gòu)改變后，極性喪失，與周?chē)?xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。EMT是目前上皮來(lái)源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因，已被證實(shí)是包括結(jié)直腸癌、肺癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6，7]。

細(xì)胞外基質(zhì)由蛋白和多糖組成，分布于全身各組織，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和組織的共存提供合適的環(huán)境。大量研究表明，ECM降解主要靠基質(zhì)金屬蛋白酶家族。它是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，幾乎可以分解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[8，9]。惡性腫瘤中存在某種因素可使MMPs過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致基質(zhì)降解，有利于腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。目前已發(fā)現(xiàn)的MMPs28種，較為重要的是MMP-2和MMP-9，其主要作用底物是包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原、明膠、彈性蛋白。李靖若等[10]報(bào)道在乳腺癌中MMP9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正比。Li HC等[11]檢測(cè)了270例腋淋巴結(jié)陰性乳腺癌中的MMP-2和MMP-9的表達(dá)，結(jié)果顯示MMP-2表達(dá)與腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)正相關(guān)，MMP-9表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)正相關(guān)。

STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員，己被公認(rèn)為是一種癌基因或類(lèi)癌基因。當(dāng)細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子等激活STAT3上游的Janus激酶（JAK）后，活化的JAK募集胞漿中以單體存在的STAT3分子，使與受體結(jié)合的STAT3分子酪氨酸磷酸化后（p-STAT3，Tyr705），STAT3形成同源或異源二聚體從受體上釋放下來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[12]。STAT3信號(hào)活化通過(guò)調(diào)節(jié)E-鈣黏素（E-cadherin）與波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤的EMT已有報(bào)道證實(shí)[3，4，13]，另有研究結(jié)果顯示STAT3信號(hào)活化能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。

本實(shí)驗(yàn)首先利用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)一組30例乳腺癌組織和癌旁組織的STAT3 mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在乳腺癌標(biāo)本中相對(duì)濃度為0.526±0.312，癌旁組織為（0.197±0.161），兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05），表明STAT3 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為了較大樣本進(jìn)一步分析STAT3在乳腺癌中的表達(dá)及其與MMPs的關(guān)系，我們以70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌為研究組，26例癌旁正常組織為對(duì)照組進(jìn)行pSTAT3、MMP-2和MMP-9的免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺癌組織中表達(dá)率分別為62.9%、72.8%、67.1%，明顯高于正常乳腺組織，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MMP-2、MMP-9在不同年齡、腫瘤大小、ER、PR表達(dá)組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間，MMP-2、MMP-9表達(dá)有顯著差異（P均< 0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了pSTAT3、MMP-2、MMP-9參與了乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程，與前述報(bào)道基本一致。

另外，對(duì)pSTAT3、MMP-2和MMP-9蛋白在乳腺癌組織中的相關(guān)性分析中，顯示pSTAT3與MMP-2、MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，提示pSTAT3可能參與了MMP-2、MMP-9表達(dá)調(diào)節(jié)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。有研究指出其機(jī)制可能是MMP-2、MMP-9作為STAT3下游靶基因，STAT3磷酸化后進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，調(diào)控MMP-2、MMP-9基因的表達(dá)[15，16]。

綜上所述，本次研究中發(fā)現(xiàn)，STAT3基因在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，其磷酸化蛋白（pSTAT3）與MMP-2、MMP-9跟乳腺癌的分化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。活化的STAT3可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)介導(dǎo)EMT，從而促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

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（收稿日期：2012-05-24）