當歸水醇提取物對哮喘患者血CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ表達的影響

[摘要] 目的 研究當歸水醇提取物對哮喘患者血CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ表達的影響。 方法 分離50例哮喘患者的外周靜脈血CD4+CD25+T調節細胞，采用Western blot研究不同濃度（3.13 ng/mL，6.25 ng/mL，12.5 ng/mL，25 ng/mL）的當歸水醇提取物對CD4+CD25+T細胞IFN—γ表達情況以及25 ng/mL的當歸水醇提取物處理CD4+CD25+T細胞不同時間（24 h、36 h、48 h）后IFN—γ表達情況。 結果 隨著當歸水醇提取物濃度的增加，CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ表達增加。隨著當歸水醇提取物處理的時間延長，CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ表達增加。 結論 當歸水醇提取物濃度對哮喘患者IFN—γ表達呈現明顯的時間—濃度依賴關系，提示當歸水醇提取物可能通過影響IFN—γ表達來影響哮喘的發生。

[關鍵詞] 當歸水醇提取物；IFN—γ；CD4+CD25+T調節細胞；哮喘

[中圖分類號] R285.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673—9701（2012）27—0045—03

The influence of angelica sinensis on IFN—γ in the CD4+CD25+T regulatory cells isolated from asthma patients

LUO Jiangxiu ZHONG Chao

Department of Pharmacy， Guangming New District People’s Hospital， Shenzhen 518106， China

[Abstract] Objective To identify the influence of angelica sinensis on INF—γ in the CD4+CD25+ T regulatory cells isolated from asthma patients. Methods Different concentration of angelica sinensis （3.13 ng/mL， 6.25 ng/mL， 12.5 ng/mL， 25 ng/mL） effected on asthma patients’ CD4+CD25+ T regulatory cells and different times of angelica sinensis （24 h， 36 h， 48 h） effected on asthma patients’ CD4+CD25+ T regulatory cells， and used Western blot to detect the expression of IFN—γ in CD4+CD25+T regulatory cells. Results The extracts from angelica sinensis could effect on human CD4+CD25+ T regulatory cells and the expression of IFN—γ was increased. Conclusion The extracts from angelica sinensis can infect the expression of IFN—γ in human CD4+CD25+ T regulatory cells.

[Key words] Extracts from angelica sinensis； IFN—γ； CD4+CD25+T regulatory cells； Asthma

在工業化日趨發展的今天，當機體吸入多種抗原后，氣道廣泛地收縮變窄，導致支氣管哮喘。目前研究表明，嗜酸性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞等多種炎性細胞參與了該病的發展過程。進一步的研究發現，其發病與Th1/Th2系統失衡和Th2細胞優勢分化相關，而來源于Th1型細胞的細胞因子IFN—γ可抑制Th2型細胞的分化，對過敏性疾病的發生產生保護作用[1]。因此對該細胞因子的進一步研究并借此來開發治療哮喘的藥物，成為學者們研究的熱點。當歸為傘形科植物當歸的干燥根，首載于《神農本草經》。當歸性甘、辛、溫，歸肝、心、大腸經，是一味常用的傳統中藥。目前主要認為當歸能夠改善機體免疫功能，提高血清中溶血素的含量，增強對免疫抑制劑的對抗作用，消除免疫復合物的沉積；并能顯著提高小鼠溶菌酶含量、巨噬細胞的活性，降低循環免疫復合物的含量從而顯著提高小鼠的非特異性免疫功能[2]。本研究擬探討當歸水醇提取物對哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞中IFN—γ表達的影響，來判斷其對哮喘的治療作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

哮喘患者43例，男23例，女20例，平均年齡（29±10）歲。按《支氣管哮喘防治指南》明確診斷，為本院2012年3～6月門診及住院患者，均未使用茶堿類藥物、糖皮質激素類藥物或停藥2周以上。健康成年人24例，平均年齡（33±11）歲，男15例，女9例，為本院健康志愿者。

1.2 試劑

RPMI—1640購自Invitrogen公司；小牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青生物技術公司；DMSO購自美國AMRESCO公司。CD4+CD25+T調節細胞的分離免疫磁珠分離試劑盒為Miltenyi公司產品，Geniu凝膠電泳圖像分析儀為SynGene公司產品。蛋白裂解液購自碧云天生物技術公司。IFN—γ抗體、二抗購自Cell Transfer Signal（CTS）公司。其余試劑為分析純。

1.3 當歸水醇提取物的制備

當歸購自老百姓大藥房，取超臨界萃取后的當歸藥材，置不銹鋼鍋中煎煮3次后，過濾，合并濾液，將加熱濃縮得到的稠膏冷卻后加入95%乙醇配成60%的醇溶液，4℃冰箱靜置24 h后，過濾，收集濾液及沉淀。沉淀物加水溶解，加95%乙醇配成80%醇溶液，4℃冰箱靜置24 h，再次過濾，沉淀物加1～2倍95%乙醇洗滌，過濾，風干。將濾液合并后蒸發濃縮，回收乙醇。濾液和沉淀物于4℃冰箱保存備用。

1.4 細胞分離培養

取患者和健康對照者靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝后分離得到外周血單個核細胞，再采用Miltenyi磁珠分選出CD4+CD25+T調節細胞，經流式細胞儀檢測細胞純度>95%。采用普通1640（10%FBS）培養基培養。

1.5 XTT法檢測當歸水醇提取物對CD4+CD25+T細胞的細胞毒性

將1×104個細胞鋪入96孔板中，并加入不同濃度的當歸水醇提取物與細胞共孵育。將100 μL PMS儲存液（100×）和9.9 mL XTT儲存液混合得到XTT工作液。加入50 μL XTT/PMS工作液，37℃孵育4 h后用多功能酶標儀檢測OD450的吸光值并計算化合物的CC50值。

1.6 免疫印跡

在收獲好的細胞中加入細胞裂解液提取蛋白，4℃離心30 min并棄除沉淀，取40 μg蛋白質加入1×SDS凝膠加樣緩沖液中，蛋白經變性、電泳、轉PDVF膜后，用5%牛奶封閉2 h，加入兔抗人的IFN—γ抗體，常溫孵育2 h，TBST洗3次，再加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗3次，用蛋白質印跡熒光檢測試劑盒顯示于X光片。結果用Geniu凝膠圖像分析系統對膠片掃描，以對照組的面積灰度值為100%與實驗組進行比較和半定量分析。

1.7 統計學處理

所有數據采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間采用方差分析，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 當歸水醇提取物對CD4+CD25+T調節細胞的細胞毒性

96孔板每孔鋪100 μL CD4+CD25+T細胞和50 μL不同濃度（0 ng/mL、3.13 ng/mL、6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、25 ng/mL）的當歸水醇提取物于37℃共孵育過夜；去除150 μL培養基后再加入150 μL新鮮培養基，再于37℃孵育72 h；加入50 μL XTT/PMS工作液，37℃孵育4 h后用多功能酶標儀檢測OD450的吸光值并計算化合物的CC50值。該化合物的CC50值>（25±4.83）ng/mL（圖1、表1）。

表1 當歸水醇提取物對CD4+CD25+T調節細胞的細胞毒性的OD值（x±s，n = 3，用藥組vs 0，*P < 0.05）

圖1 當歸水醇提取物對CD4+CD25+T調節細胞的細胞毒性（x±s，n = 3）

2.2 不同濃度的當歸水醇提取物對CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ蛋白表達的影響

分別用不同濃度（3.13 ng/mL、6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、25 ng/mL）的當歸水醇提取物處理CD4+CD25+T調節細胞48 h，與對照組（0 ng/mL）比較，隨著當歸水醇提取物濃度的增加，IFN—γ的表達明顯增加。說明當歸水醇提取物促進IFN—γ蛋白表達，并且呈濃度依賴性（表2、圖2）。

表2 當歸水醇提取物對IFN—γ蛋白表達的影響的相對光密度

（x±s，n = 3，用藥組vs 0，*P < 0.05）

圖2 當歸水醇提取物對CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ蛋白表達的影響（x±s，n = 3；1：健康人群組，2～5：不同藥物處理組；2：3.13 ng/mL，3：6.25 ng/mL，4：12.5 ng/mL，5：25 ng/mL）

2.3 當歸水醇提取物處理CD4+CD25+T調節細胞不同時間IFN—γ蛋白表達的情況

分別用25 ng/mL的當歸水醇提取物處理CD4+CD25+T調節細胞不同時間（24 h、48 h、72 h）與對照組（0 h）比較，隨著當歸水醇提取物作用時間的增加，IFN—γ的表達明顯增加。說明當歸水醇提取物處理CD4+CD25+T調節細胞不同時間后，IFN—γ蛋白表達增加，并且呈時間依賴性（表3、圖3）。

表3 當歸水醇提取物處理細胞不同時間后IFN—γ蛋白表達的情況

（x±s，n = 3，時間組vs 0，*P < 0.05）

圖3 不同時間下當歸水醇提取物對CD4+CD25+T調節細胞IFN—γ蛋白表達的影響（x±s，n = 3；1：0 h，2：24 h，3：48 h，4：72 h）

3 討論

在多種炎癥細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞等共同參與下，支氣管哮喘往往表現為慢性氣道炎癥。目前研究表明，哮喘發病過程中免疫功能紊亂占主導地位，而輔助性T細胞在其中更是發揮著關鍵性作用[3]。CD4+CD25+調節性T細胞因為能夠同時抑制Th1和Th2細胞而成為研究的熱點。研究表明，該細胞通過影響Th2細胞分泌IFN—γ的功能而對實驗性哮喘具有保護作用[4]。

研究表明，Ⅰ型IFNs（IFN—α和IFN—β）和Ⅲ型IFNs（IFN—λ）在對抗病毒感染的天然免疫中發揮重要作用，但是在哮喘患者上皮細胞中IFN—α和IFN—λ表達減少且與鼻病毒復制增加相關，可能是哮喘患者病毒性加重的先兆[5，6]。天然免疫中這些缺陷的分子機制還不清楚。在嚴重糖皮質激素抵抗的哮喘患者中低劑量的IFN—α有明顯的效用，但是機制不清楚[7]。提示促進體內IFN—γ生成增加有可能是防治哮喘的一種思路。現代醫學研究證明，當歸水醇提取物具有增強機體免疫功能、抗衰老等方面的作用。該藥還有類似性激素樣的作用，對免疫功能低下小鼠具有免疫增強功能[8]。本實驗通過分離哮喘患者外周血的CD4+CD25+調節性T細胞，研究當歸水醇提取物與IFN—γ蛋白時效及量效關系，并且研究了當歸水醇提取物對細胞的毒性，結果發現，當歸水醇提取物的CC50值>（25±4.83） ng/mL；細胞經當歸水醇提取物處理后，IFN—γ蛋白表達均增加。提示當歸水醇提取物可能靶向CD4+CD25+調節性T細胞中的IFN—γ的來影響哮喘的發病過程。針對IFN—γ蛋白為靶點開發藥物，可以為治療哮喘提供思路，并且該類化合物有望開發成治療哮喘的藥物。

[參考文獻]

[1] Deng Y，Chen W，Zang N，et al. The antiasthma effect of neonatal BCG vaccination does not depend on the Th17/Th1 but IL—17/IFN—gamma balance in a BALB/c mouse asthma model[J]. J Clin Immunol，2011，31（3）：419—429.

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[3] Wei B，Zhang H，Li L，et al. T helper 17 cells and regulatory T—cell imbalance in paediatric patients with asthma[J]. J Int Med Res，2011，39（4）：1293—1305.

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[8] 鄭漢臣，蔡少青. 生藥學[M]. 第4版. 北京：人民衛生出版社，2004：348.

（收稿日期：2012—07—12）