miR—218下調(diào)與宮頸癌發(fā)生相關(guān)性的初步研究

[摘要] 目的 初步探討miR—218與宮頸癌發(fā)生發(fā)展以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。 方法 選取25例正常宮頸組織、35例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織和52例宮頸癌組織，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR—218的相對(duì)表達(dá)量，初步探討miR—218的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系。 結(jié)果 與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和宮頸癌組織的miR—218表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織相比，宮頸癌組織的miR—218表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。比較腫瘤直徑大小、不同年齡、臨床分期和絕經(jīng)與否的宮頸癌組織中miR—218表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；而比較不同的病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否在宮頸癌組織中miR—218相對(duì)表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 miR—218的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，為腫瘤靶向治療提供了新靶點(diǎn)，并可作為治療宮頸癌及評(píng)價(jià)預(yù)后的參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變；miRNA；miR—218

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673—9701（2012）27—0028—02

Preliminary research on the correlation between miR—218 down—regulation and cervical cancer

GAI Hongxia

Xunhua Salar Autonomous County Family Planning Publicity and Technical Guidance Station， Qinghai Province， Xunhua 811100， China

[Abstract] Objective To discuss the correlation between miR—218 and cervical cancer development as well as the invasion of metastasis. Methods Selected 25 cases of normal cervical tissue， 35 cases of cervical intraepithelial neoplasia tissue and 52 cases of cervical cancer tissues，to detect the relative expression level of miR—218 by real—time fluorescence quantitative PCR， then studied the relationship between preliminary study of miR—218 expression and cervical cancer relationship. Results Compared with normal cervical tissue， the expression levels of miR—218 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer tissues were decreased， the difference was significant of statistics （P < 0.05）. Samely， compared with cervical intraepithelial neoplasia， the expression of cervical cancer miR—218 was decreased， the difference was also significant of statistics （P < 0.05）. The miR—218 expression levels of cervical cancer with different pathological grade， stromal invasion depth and lymph node metastasis had no statistically significant difference （P > 0.05）. However， miR—218 expression level of cervical cancer with different systematics of pathology， stromal invasion depth， lymph node metastasis， had significant difference of statistics （P < 0.05）. Conclusion The expression of miR—218 is related with the development， metastasis and invasion of cervical cancer， which can provide a new target for cancer therapy， and can as a reference index for medical treatment of cervical cancer and the evaluation of the prognosis.

[Key words] Cervical cancer； Cervical intraepithelial neoplasia； miRNA； miR—218

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年大約有10萬(wàn)以上的宮頸癌新發(fā)病例。近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，成為嚴(yán)重威脅中青年婦女健康和生命的疾病[1，2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸。miRNA在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是一類(lèi)潛在的癌基因或抑癌基因。另外還在動(dòng)物的發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道稱(chēng)miRNA—218在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中存在差異性表達(dá)[3]，但是miR—218與宮頸癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及侵襲力等相關(guān)性的報(bào)道尚少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Trizol試劑，M—MuLV First Stand cDNA Synthesis Kit，Ready—To—Use PCR Kit，Hot Start Fluorescent PCR Core Kit等購(gòu)于BBI公司。

1.2 標(biāo)本采集

選取2009年3月～2010年9月在我院接受宮頸錐切術(shù)112例，其中25例正常宮頸組織、35例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變和52例宮頸癌組織。患者平均年齡38歲（32～65歲），無(wú)其他疾病。參與本研究的患者均已簽署知情同意書(shū)。將收集到的組織在20 min內(nèi)凍存于—80℃中。

1.3 miR—218的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

用Primer premer5.0軟件設(shè)計(jì)引物后交上海生物工程公司合成。引物序列為：β—actin正義鏈：5′GATGAGACTCTAGACTCATG 3′，反義鏈：5′GCTCTACACTATCGAGCAT3′；miR—218正義鏈：5′GGAGTGGCGAATGGTAGTGGAGT3′，反義鏈：5′ACCAGGCTGGACAGTAGAGCG3′。Trizol法提取總RNA，合成cDNA后測(cè)定引物特異性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定各目的基因mRNA的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其中計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析、t檢驗(yàn)或Dunnett—t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三種宮頸組織中miR—218的相對(duì)表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線平滑，各基因均有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，溶解曲線單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增（圖1、2）。設(shè)正常宮頸組織miR—218表達(dá)量為1，宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織與之比較其相對(duì)表達(dá)量（圖3）。結(jié)果顯示與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和宮頸癌組織的miR—218表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織相比，宮頸癌組織的miR—218表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

宮頸癌組織miR—218的表達(dá)與臨床病理特征的聯(lián)系：不同的病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否在宮頸癌組織中miR—218相對(duì)表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而比較腫瘤直徑大小、不同年齡、臨床分期和絕經(jīng)與否的宮頸癌組織中miR—218表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖2 SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線

圖3 不同組織中miR—218的相對(duì)表達(dá)量

1：正常宮頸組織；2：宮頸上皮內(nèi)瘤變組織；3：宮頸癌組織 *P < 0.01 vs正常宮頸組織；#P < 0.01 vs宮頸上皮內(nèi)瘤變組織

表1 宮頸癌組織miR—218表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是世界上最常見(jiàn)的婦科腫瘤，其發(fā)病率近年來(lái)呈逐漸上升趨勢(shì)。宮頸癌的病因復(fù)雜，與染色體突變、HPV感染、單核苷酸多態(tài)性變化等密切相關(guān)[4]。大量研究證實(shí)，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)都伴隨著微小RNA表達(dá)量的變化，如直腸癌、淋巴瘤、肺癌等[5]。Lui WO等[6]應(yīng)用克隆測(cè)序法分析了正常宮頸組織和人宮頸癌細(xì)胞株兩種基因組中miRNA編碼位點(diǎn)拷貝數(shù)缺失和（或）擴(kuò)增的情況，結(jié)果顯示在宮頸癌細(xì)胞株中miR—21表達(dá)上調(diào)，而miR—196b、miR—23b和miR—143表達(dá)顯著下調(diào)。近年miR—218在腫瘤中的異常表達(dá)備受關(guān)注，多種惡性腫瘤中存在的miR—218表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，如宮頸癌、胃癌、乳腺癌[7，8]。

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了正常組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及宮頸癌組織中miR—218表達(dá)的變化，得知宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)miR—218表達(dá)下調(diào)，而宮頸癌時(shí)miR—218表達(dá)下調(diào)更顯著。通過(guò)比較宮頸癌組織中腫瘤直徑的大小、不同年齡、臨床分期和絕經(jīng)與否與miR—218表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果提示miR—218表達(dá)水平與以上四個(gè)因素關(guān)系不密切。而通過(guò)比較宮頸癌組織中不同的病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否與miR—218表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明miR—218表達(dá)下調(diào)與該三方面的因素密切相關(guān)。說(shuō)明miR—218表達(dá)水平下調(diào)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并與宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。因此miR—218為腫瘤靶向治療提供了新靶點(diǎn)，并可作為治療宮頸癌及評(píng)價(jià)預(yù)后的參考指標(biāo)。

隨著基因組技術(shù)的突飛猛進(jìn)，研究非編碼序列的臨床意義越來(lái)越重要。深入研究微小RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，不僅可以為尋找腫瘤特異性診斷的標(biāo)志物提供依據(jù)，還能提供治療腫瘤的新靶點(diǎn)[9，10]。如能有效地將特異的miRNA或者其抑制劑轉(zhuǎn)入宮頸癌的癌細(xì)胞中，同樣能提高對(duì)宮頸癌的早期診斷、治療和判斷預(yù)后。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 郭曉紅. 宮頸癌差異蛋白的表達(dá)及化療藥物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的作用[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2009.

[2] 孫海玲，馮麗華. HPV檢測(cè)在宮頸疾病檢查中的臨床意義[C]. 東北三省第四屆婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2008：97—98.

[3] 李英杰. miR—218與宮頸癌惡性程度的相關(guān)性及其作用機(jī)制的初步探討[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2010.

[4] Tsubokura M，Komatsu T，Kami M. The prevalence of high—risk human papillomavirus in women with different types of cervical cancer[J]. Ann Intern Med，2008，149（4）：283.

[5] 程靜，趙華，印永祥，等. miR—101在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國(guó)婦幼保健，2012，27（7）：1072—1073.

[6] Lui WO，Pourmand N，Patterson BK，et al. Patterns of known and novel small RNAs in human cervical cancer[J]. Cancer Res，2007，67（13）：6031—6043.

[7] Gao C，Zhang Z，Liu W，et al. Reduced microRNA—218 expression is associated with high nuclear factor kappa B activation in gastric cancer[J]. Cancer，2010，116（1）：41—49.

[8] Iorio MV，Casalini P，Tagliabue E，et al. MicroRNA profiling as a tool to understand prognosis，therapy response and resistance in breast cancer[J]. Eur J Cancer，2008，44（6）：2753—2759.

[9] Chen X，Guo X，Zhang H，et al. Role of miR—143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis[J]. Oncogene，2009，28（10）：1385—1392.

[10] Osaki M，Takeshita F，Ochiya T. MicroRNAs as biomarkers and therapeutic drugs in human cancer[J]. Biomarkers，2008，13（7）：658—670.

（收稿日期：2012—06—07）