肺炎克雷伯菌對β—內酰胺類抗生素耐藥性主決定因素的研究

[摘要] 目的 了解肺炎克雷伯菌對β—內酰胺類抗生素耐藥性及耐藥性特點，并探究其主決定因素。 方法 對臨床送檢的痰液、咽拭子、氣管分泌物等做細菌培養，根據藥敏試驗結果分為敏感菌株、泛耐藥菌株、多重耐藥菌株3種菌株。分析菌株β—內酰胺酶活性以及細胞外膜通透性的變化。 結果 與敏感菌株組β—內酰胺酶活性（12±6） U/mg比較，泛耐藥菌株組β—內酰胺酶活性（253±36） U/mg，多重耐藥菌株組β—內酰胺酶活性均明顯增多，差異顯著，有統計學意義（P < 0.05）。而泛耐藥菌株組β—內酰胺酶活性表達最高；與敏感菌株組細胞外膜通透性比較，泛耐藥菌株組細胞外膜通透性、多重耐藥菌株組細胞外膜通透性具有明顯的阻礙作用，差異顯著，有統計學意義（P <0.05）。而泛耐藥菌株組細胞外膜通透性阻礙作用最強。 結論 β—內酰胺酶活性和細胞外膜通透性是肺炎克雷伯菌對β—內酰胺類抗生素耐藥性的主決定因素。

[關鍵詞] 肺炎克雷伯菌；β—內酰胺類抗生素；決定因素

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673—9701（2012）27—0138—02

Klebsiella pneumoniae to β—lactam antibiotic drug resistance lord of the determinants of research

ZHOU Qisheng LIU Yutian HUANG Miaojuan LIU Cihua

Internal Medicine， Pengpai Memorial Hospital of Haifeng County in Guangdong Province， Haifeng 516400， China

[Objective] Abstract About Klebsiella pneumoniae to β—lactam antibiotic resistance and resistance characteristics， and explore the deciding factor. Methods Strains of clinical sputum， throat swabs， tracheal secretion do the bacteria cultures， according to drug sensitivity test results are divided into： Sensitive strain group， Pan resistant strains group， Multiple drug—resistant strains of the three groups. Analysis strains β—lactamase activity and a cell's outer membrane permeability changes. Results The results and sensitive strain group β—lactamase activity（12±6） U/mg comparison， Pan resistant strains group β—lactamase activity （253±36） U/mg， Multiple drug—resistant strains group β—lactamase activity were significantly increased， Significant difference， with a statistical significance（P < 0.05）. And the Pan resistant strains group β—lactamase activity expression is the highest. And sensitive strain group a cell's outer membrane permeability comparison， Pan resistant strains group β—lactamase activity， multiple drug—resistant strains group a cell's outer membrane permeability has obvious side effect， Significant difference， with a statistical significance（P < 0.05）. And pan resistant strains group cell's outer membrane permeability obstruct the strongest. Conclusion β—lactamase activity and a cell's outer membrane permeability is K lebsiella pneumoniae to β—lactam antibiotic drug resistance the deciding factors.

[Key words] Klebsiella pneumoniae； β—lactam antibiotic； Decision factors

造成院內患者囊性纖維化、傷口感染及呼吸道感染患者肺炎流行的條件致病菌[1]主要是肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌感染的發生率幾年來保持較高水平，而且隨著抗生素的廣泛應用，肺炎克雷伯菌對較廣范圍的抗生素產生了固有耐藥性及多重耐藥性[2]，所以有必要探討肺炎克雷伯菌耐藥的機制，以尋找更有效的抗生素。我們對幾類肺炎克雷伯菌進行耐藥機制分析，評價不同耐藥因素影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本

收集2009年5月～2011年12月在我院門診臨床送檢的痰液、咽拭子、氣管分泌物等并制成標本鋪在血平板上，置于37℃，約12～24 h，在一般情況下培養，再將培養的肺炎克雷伯菌接種于細菌藥敏板條及生化板條，24 h后觀察結果。根據實驗結果分為3組：①敏感菌組，對所有抗生素均敏感的肺炎克雷伯菌62株；②多重耐藥組，對部分抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌66株；③泛耐藥組，對所有抗生素均耐藥的肺炎克雷伯菌63株。

1.2 β—內酰胺酶活性測定

將肺炎克雷伯菌接種于MH瓊脂平皿中，培養基含有氨芐西林45 mg/L的terrificbroth 5～7 mL，37 ℃10 h，接種于含氨芐西林50 mg/L的terrific broth培養基1000 mL，37℃12 h，至其光密度達OD600=0.9（對數生長后期）。Lowry法測定β—內酰胺酶蛋白含量。利用Perkin—Elmerλ2紫外/可見分光光度計進行時間動態掃描測定，時間間隔0.1 min，波長490 nm，濕度25 ℃，底物為0.2 mmol/L的nitrocefin pH 7.0，在規定條件下使底物吸光度每分鐘增高1A的β—內酰胺酶活性為1個單位（U）。根據單位蛋白重量測定計算每株菌的β—內酰胺酶的活性[3]。運用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）進行分析，不同菌株之間進行差異比較。

1.3 細胞膜通透性測定

在Terrific Broth各組菌株培養24 h，按1∶50接種于新鮮的Terrific Broth，37 ℃，2～3 h，OD600=0.9，4℃，4 000 g離心，6 min后開始收集菌體，在 pH為7.0情況下，用10 mL的100 mmol/L PBS洗滌1次， 其次將菌體懸浮于5 mL的PBS溶液中，置于冰塊中留以備用。把上面的菌體懸浮液加入到96孔微孔板中，共加入36個孔，每個孔0.05 mL，其中18孔加入2.5%的辛基聚環氧乙烷各0.01 mL，另外18孔加緩沖液各0.01 mL，再加入抗生素溶液0.01 mL，抗生素溶液呈系列稀釋，37℃，5 min后，加入0.1 mmol/L nitrocefin的磷酸鈉緩沖液，0.1 mL含5%的O—POE，測定β—內酰胺酶活性[4]。

1.4 統計學分析

所得數據采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料采用以均數±標準差（x±s）表示，多組間計量資料比較采用方差分析，兩組間比較用t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與敏感菌株組β—內酰胺酶活性比較，泛耐藥菌株組β—內酰胺酶活性、多重耐藥菌株組β—內酰胺酶活性均明顯增多，差異有統計學意義（P < 0.05），而泛耐藥菌株組β—內酰胺酶活性表達最高。與敏感菌株組細胞外膜通透性比較，泛耐藥菌株組細胞外膜通透性、多重耐藥菌株組細胞外膜通透性具有明顯的阻礙作用，差異有統計學意義（P < 0.05），而泛耐藥菌株組細胞外膜通透性阻礙作用最強。見表1。

表1 三組菌株β—內酰胺酶活性、外膜不通透性測定

注：與敏感菌株組比較，aP < 0.05；與泛耐藥菌株組比較，bP < 0.05；t = 3.35為敏感菌株組與泛耐藥菌株組比較，t = 2.85為多重耐藥菌株組與泛耐藥菌株組比較，t = 6.74為敏感菌株組與泛耐藥菌株組比較，t = 4.78為多重耐藥菌株組與泛耐藥菌株組比較。

3 討論

肺炎克雷伯菌在普通培養基上就可以生長，其本身沒有鞭毛夾膜很厚是革蘭氏隱性球桿形細菌，并且其生長所需要的營養不是很高，菌落呈現黏液狀而且比較大，環挑菌株易拉成絲為特征[5，6]。肺炎克雷伯菌是人類腸道和呼吸道的常見菌、致病菌，可引起手術切口、泌尿道、呼吸道、血液、腸道等多個部位感染炎癥[7]。

近年來肺炎克雷伯菌感染有明顯上升的趨勢，但是由于各種抗菌藥物的廣泛使用，從呼吸道檢出肺炎克雷伯氏菌耐藥性較高，這給臨床醫治上造成了一定壓力。研究表明，不同菌株內的β—內酰胺酶的活性有很大區別，細菌對β—內酰胺類抗生素的耐藥性與β—內酰胺酶水平成正比關系。本研究也證實了這一點，研究結果可以看出，與敏感菌株組（A組）β—內酰胺酶活性比較，泛耐藥菌株組（B組）β—內酰胺酶活性和多重耐藥菌株組（C組）β—內酰胺酶活性均明顯增多，差異顯著，有統計學意義（P < 0.05）；而泛耐藥菌株組β—內酰胺酶活性表達最高。泛耐藥菌株的β—內酰胺酶活性最強說明β—內酰胺酶活性是反映耐藥性的一個重要因素。主要是因為廣譜β—內酰胺酶可通過細菌間基因的轉化、擴散、轉導、接合，造成治療上的困難和院內感染的多發[8，9]，主要是因為一個菌株具備了耐藥性，使細菌耐藥性基因不斷傳播。

從菌株的細胞膜的通透性來看，與敏感菌株組細胞外膜通透性比較，泛耐藥菌株組細胞外膜通透性、多重耐藥菌株組細胞外膜通透性具有明顯的阻礙作用，差異有統計學意義（P < 0.05）。而泛耐藥菌株組細胞外膜通透性阻礙作用最強?？梢娒舾芯晖ㄍ感宰詈?，泛耐藥菌株細胞膜通透性較差，細胞外膜通透性阻礙作用最強。細菌在生長的過程中是通過其附著結構或鞭毛牢固地附著在固體表面，進行分裂、繁殖和生長，由細菌內的細胞開啟信號，再由細胞內信號系統的調節，然后細菌一邊從固體表面形成多蘑菇樣亞單位或細菌柱體，一邊分泌胞外多糖Eps。成熟的細菌生物被膜是由許多個亞單位形成的。生物被膜是細菌的特殊存在形式。生物被膜中細菌β—內酰胺酶合成以及分泌的碳氫化合物被膜，可阻止抗生素穿入。從而產生抗藥性，而通透性的改變決定了細菌的耐藥性[10]。

綜上所述，β—內酰胺酶活性和細胞外膜通透性是肺炎克雷伯菌對β—內酰胺類抗生素耐藥性的主決定因素，對抗生素的篩選有一定指導意義。

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（收稿日期：2012—04—27）